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背景LIM和SH3蛋白-1（LASP-1）是连接LIM和SH3结构域的第一个蛋白,并且有两个伴肌动蛋白样重复,主要聚集在细胞的粘着斑,伪状足的前缘以及丝状伪足的密集处,可以启用细胞粘附,迁移和蜂窝通信等重要功能。LASP-1蛋白在许多实体肿瘤组织中呈现高表达,更为重要的是,高表达的LASP-1与肿瘤的恶性功能密切相关,例如:增殖、侵袭和转移等。目前LASP-1作为一种新的肿瘤转移相关蛋白。我们在前期研究中发现,与正常胰腺组织相比较,胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC）组织中及永生化细胞系中LASP-1蛋白过度表达。我们设计本课题,拟进一步明确LASP-1在PDAC组织及永生化细胞系中的定位情况及表达方式;从临床水平、细胞水平及动物实验水平探索LASP-1的功能及其分子调控机制。方法1.应用新鲜的胰腺导管腺癌（PDAC）组织及石蜡包埋标本,进行蛋白印迹（Western blot）、反转录PCR（RT-PCR）和免疫组织化学染色,分析LASP-1在胰腺不同组织中的表达水平。2.应用蛋白印迹（Western blot）、反转录PCR（RT-PCR）等实验技术检测胰腺导管腺癌永生化细胞系（（Immortal cell line））中LASP-1的表达水平;进一步通过Wound healing实验（划痕实验）、Transwell及免疫荧光等实验方法探讨LASP-1对胰腺导管腺癌细胞系运动、迁移及侵袭等恶性功能的影响。3.应用分子克隆方法构建乏氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）过表达质粒及HIF-1α小干扰RNA（siRNA）,分别瞬时转染（Transient transfection）胰腺导管腺癌细胞系,应用蛋白印迹（Wb）、反转录PCR等实验技术验证HIF-1α和LASP-1二者的表达相关性。4.搜索LASP-1的基因启动子区,发现含有4个低氧反应元件（HREs:A/GCGTG）,通过染色质免疫共沉淀（ChIP）及双萤光素酶实验验证是否HIF-1α可以直接结合于LASP-1的启动子区,调控其表达。5.构建裸鼠（Nude Mouse）皮下移植瘤模型,应用HIF-1α抑制剂（地高辛）,检测肿瘤的增殖情况,并通过Western blot和免疫组织化学的方法,探讨HIF-1α和LASP-1的表达相关性;对人PDAC石蜡包埋标本进行连续切片,应用免疫组织化学的方法,探讨HIF-1α和LASP-1的表达相关性。6.应用分子克隆技术构建LASP-1过表达（Overexpression）质粒,构建慢病毒（Lentivirus）稳定表达系统,建立稳定过表达LASP-1的胰腺导管腺癌细胞系;用Western blot、RT-PCR检测所构建稳系LASP-1的表达水平;应用裸鼠（Nude mice）构建胰腺原位癌模型,比较原位肿瘤的大小及腹腔转移情况。7.搜集患者的临床资料并进行预后随访,分析LASP-1的表达水平与临床病理参数之间的关系。结果1.LASP-1在胰腺导管腺癌标本中的表达差异及定位情况。通过对新鲜胰腺导管腺癌组织标本进行Western blot、反转录PCR方法检测,发现与癌旁组织相比,肿瘤组织中LASP-1蛋白及mRNA的表达水平明显增加（P<0.05）;进而通过对91例胰腺导管腺癌组织标本进行免疫组化染色（Immunohistochemistry）发现,LASP-1高表达于胰腺导管腺癌细胞中,而在正常胰腺组织,低度恶性肿瘤中不表达或弱表达;2.LASP-1在胰腺导管腺癌细胞系中的表达及其功能探讨。Western blot方法检测胰腺导管腺癌细胞系（CFPAC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3及PANC-1）的基础表达,发现CFPAC-1和MIA PaCa-2细胞高表达LASP-1蛋白,而BxPC-3和PANC-1细胞系则低表达LASP-1;通过Western blot、RT-PCR实验方法,分别验证了LASP-1过表达质粒及小干扰RNA的表达效率;应用Transwell和划痕实验分别检测LASP-1对细胞的迁移侵袭能力的影响,结果显示:予以CFPAC-1、MIA PaCa-2细胞系降低LASP-1表达后,与对照组相比细胞的迁移及侵袭能力明显降低,相反,予以BxPC-3和PANC-1细胞过表达LASP-1后,细胞的迁移及侵袭能力明显增强;进一步免疫荧光实验我们发现LASP-1蛋白与细胞骨架F-actin蛋白有明显的共定位情况,即过表达LASP-1后,细胞的形态发生明显改变,粘着斑、片足、膜皱襞和伪足明显增加,并且与F-actin的共定位明显增加,反之亦然。3.HIF-1α与LASP-1的表达之间存在正相关性。成功构建了HIF-1α过表达质粒及HIF-1α小干扰RNA,发现降低HIF-1α的表达（CFPAC-1细胞）和增加HIF-1α的表达后（PANC-1细胞）后,LASP-1的表达水平亦发生明显改变,即LASP-1的表达随着HIF-1α的表达发生正相关性改变;进而通过对胰腺导管腺癌细胞系（BxPC-3、CFPAC-1、MIA PaCa-2及PANC-1）进行乏氧处理,结果亦发现随着HIF-1α表达的增加,LASP-1蛋白也出现上升趋势,即二者表达呈现正相关性。4.HIF-1α直接结合于LASP-1的基因启动子区,并且上调其表达活性。搜索LASP-1的基因启动子区,发现含有4个低氧反应元件（HRE）（HRE1:-1005-1001;HRE2:-1100-1096;HRE3:-1306-1302;HRE4:-1425-1421）,通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方法,发现HIF-1α可以结合于LASP-1的基因启动子区的第一个HRE区,并且乏氧处理后,二者结合明显增加（p<0.01）;为了验证LASP-1启动子的活性,我们应用Dual-Luciferase（双萤光素酶）实验,构建了pGL3-Empty Vector、pGL3-LASP-1（HRE1）和pGL3-LASP-1-mutation（HRE1）质粒,与pcDNA3.1和pcDNA-HIF-1α共转染,发现HIF-1α能明显上调LASP-1启动子区的活性（HRE1）,差异具有统计学意义（p<0.01）。5.体内动物实验证实HIF-1α与LASP-1的表达相关性。构建裸鼠（Nude Mouse）皮下移植瘤模型,应用HIF-1α抑制剂（地高辛）,发现地高辛能明显抑制肿瘤的生长;通过Western blot方法,证实地高辛抑制HIF-1α表达的同时,LASP-1的表达也随之减少;对人胰腺导管腺癌及小鼠胰腺导管腺癌石蜡标本进行连续切片,应用免疫组织化学的方法,发现HIF-1α和LASP-1的表达存在共定位现象,并且统计学分析发现二者表达具有相关性（p<0.001）。6.体内、外回复实验确证HIF-1α通过LASP-1影响胰腺导管腺癌的侵袭及转移等恶性行为。应用瞬时转染技术,在降低HIF-1α表达的基础上,予以过表达LASP-1,结果显示:过表达LASP-1可以逆转由于HIF-1α低表达引起的胰腺导管腺癌细胞迁移及侵袭能力的降低;体内实验结果同样证实:过表达LASP-1可以明显增加胰腺导管腺癌的肝脏、肠壁、肠系膜等处的转移能力。7.对LASP-1的免疫组织化学染色进行评分,分级,并与临床病理参数进行统计,发现LASP-1蛋白在胰腺导管腺癌标本中有87.9%的表达率,并且高LASP-1水平与较晚TNM分期及淋巴结转移密切相关（p值分别为0.010,0.001）,并且影响患者的总体生存（p<0.01）。结论1.LASP-1在胰腺导管腺癌组织及细胞系中异常高表达,并且与胰腺导管腺癌细胞的迁移及侵袭功能密切相关。2.HIF-1α直接结合于LASP-1基因启动子区的第一个HRE区,并且上调其表达活性。3.LASP-1与患者的TNM分期及淋巴结（lymph node）转移密切相关,并且影响患者的总体生存。