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高粱作为单子叶禾本科C4植物,在粮食、饲料和能源生产方面具有很大潜力。航空诱变高粱突变体har1具有矮生、早熟且每穗粒数和千粒重增加的丰产性状,并表现出蓝光超敏感的表型特征,本研究以该突变体har1及其相应野生型R111为材料,系统研究了蓝光介导的高粱幼苗去黄化形态特征,并进一步探究蓝光介导的去黄化过程中中胚轴伸长反应的分子机理。本研究有助于了解禾本科植物去黄化反应的分子机理,为高粱分子设计育种奠定基础。
萌发的高粱种子经6h远红光预培养,进行连续黑暗或12 h蓝光/12 h黑暗的蓝光周期培养,每24 h测量其形态指标。结果表明,黑暗条件下har1和R111黄化苗中胚轴长度无明显差异,蓝光条件下har1较R111幼苗明显矮化,胚芽鞘、中胚轴、第一叶鞘以及第二叶鞘的伸长受到不同程度的抑制,其中中胚轴仲长抑制程度最为明显。
本实验通过添加外源GA3及GA生物合成抑制剂PAC,和内源激素含量测定,确定蓝光调节的下胚轴伸长抑制与GA相关。施加PAC后,R111幼苗生长受到抑制,与har1的幼苗高度相似;施加GA3能恢复har1的矮化表型,表明,har1中GA3受体的功能(或信号途径)并未缺失,也暗示蓝光引起的该突变体矮化可能与GA信号途径有关。石蜡切片法分析细胞大小的结果表明,har1的细胞的平均长度明显小于野生型的细胞长度,而外源GA3显著促进细胞的伸长,为其恢复har1的矮化表型提供了细胞水平的证据。利用高效液相色谱法测定高粱幼苗去黄化过程中中胚轴内源GA3、IAA和ABA含量的结果表明,在黑暗条件下,R111和har1中内源GA3均保持在约0.8μg/g·FW的水平;蓝光处理后,R111和har1中GA3含量出现相似的变化趋势,即瞬时升高(0.5 h内),然后急剧下降(2.5 h最低),随后又缓慢升高,但蓝光处理后har1中胚轴GA3含量下降程度较R111更为明显,尤其是在照光的最初4 h内,表明har1的矮化与内源GA3水平较低有关。R111和har1的内源IAA的含量随时间的变化趋势呈现先升高随之下降的趋势,但两者之间差异不明显。R111和har1内源ABA的含量在黑暗中分别为0.07和0.1μg/g·FW,照射蓝光后,R111的ABA含量呈现小幅度下降,har1的ABA含量则在照光后0.5 h明显升高,随后明显下降,但是har1中胚轴ABA含量始终高于R111,0.5 h时最为明显。推测,har1的蓝光超敏感反应则可能与其中ABA含量变化有关。
利用TARI(http://www:arabidoosis.org)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov数据库信息,采用同源序列比对的方法,在高粱基因组信息(http://genome.jgi-psf.org/Sorbil/Sorbil.home.html)中搜索获得编码高粱蓝光信号途径关键组分(SbCRY,SbCOP1和SbHY5)、GA合成途径关键酶(SbGA20ox、SbGA3ox和SbGA2ox)及GA信号途径的抑制因子DELLAs的候选基因,并运用实时定量PCR的方法检测了蓝光、外源GA3和PAC处理条件下R111和hat1中胚轴中上述基因的表达水平变化。结果:1)较之GA20ox和GA3ox,催化活性GA钝化的GA2ox表达水平最高,且照蓝光后,har1中GA2ox表达水平升高程度较R111更为明显,推测该基因表达水平的变化与高粱幼苗中内源水平变化GA3密切相关。2)检测的5个GA信号途径抑制因子DELLA的基因水平结果表明,在蓝光抑制单子叶禾本科植物高粱中胚轴伸长过程中,GA信号途径的DELLA基因转录水平的变化可能参与了反应,且har1对蓝光的超敏感反应也与DELLA基因转录水平的变化有关。3)SbCRY1b和SbCOP1可能也参与了蓝光诱导的har1幼苗的去黄化反应。
将高粱蓝光受体基因SbCRY1b及其片段SbCNT1b和SbCCT1b构建超表达载体,转化了水稻日本晴野生型,通过PCR、Southern-blot和RT-PCR等方法对SbCRY1b转基因株系进行鉴定,获得了SbCRY1b高水平表达的转基因株系。对SbCRY1b转基因水稻株系进行了初步的表型分析,75%左右的株系表现出不同程度的矮化,表明SbCRY1b可以介导蓝光条件下叶鞘和胚芽鞘的伸长抑制。