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济宁青山羊是我国重要的山羊品种资源，具有性成熟早，繁殖率高，四季发情，遗传性稳定，适应性强，肉质鲜美等优良的种质特性，是独特的羔皮品种;沂蒙黑山羊是山东省地方优良肉用品种，但性成熟相对较晚，繁殖率相对较低;二者繁殖性状具有明显的差异。有关两种山羊性成熟、繁殖率、多胎性等生物学特性的遗传差异机制是多年来国内外研究学者关注的科学问题，是否与雌激素受体的表达、分布及其功能存在内在的联系目前尚不完全清楚。但目前有关济宁青山羊和沂蒙黑山羊两种亚型的雌激素受体(ERα/β)基因克隆尚未见报道，另外，由于缺乏对它们进行特异性结合的抗体，也限制了对雌激素受体分布、表达及其功能的研究。
本研究旨在克隆济宁青山羊和沂蒙黑山羊雌激素受体基因，分析基因结构和功能特性，进行原核表达，制备多克隆抗体，建立免疫组化分析方法，检测山羊卵巢和子宫内ERs的分布。根据GenBank发布的绵羊ERα和ERβ基因序列设计引物，应用RT-PCR方法从济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢组织中扩增ERα和ERβ基因。经双酶切和测序分析后，连接到原核表达载体pET32a(+)，构建重组表达载体pET32a(+)-ERα和pET32a(+)-ERβ，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定;经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并检测抗体效价及特异性;使用该抗体检测济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERα和ERβ的分布。实验结果显示:
1.克隆出济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因的全部开放阅读框，长度分别为1791bp和1584bp。分析与其它物种同源性并构建基因进化树，显示雌激素受体基因在物种进化过程中呈现了高度的保守性，比较了两种山羊雌激素受体氨基酸序列及蛋白空间结构差异，ERβ的变异程度较ERα更大。
2.成功构建原核表达载体pET32a(+)-ERα和pET32a(+)-ERβ，重组载体可在BL21(DE3)宿主菌中进行高效表达，表达出分子量约为45ku和53ku的融合蛋白;Western blotting证明两种融合蛋白能均能与兔抗人的ERs多克隆抗体特异性反应，制备的多克隆抗体经ELISA检测效价均达到1∶214以上，以此抗体代替购置的标准兔抗人ERs抗体，进行Western blotting反应，特异性良好。
3.建立了可靠的检测两种亚型雌激素受体分布的免疫组化方法，对济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢、子宫等组织检测结果表明，ERα和ERβ在济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫的分布情况大致相同。在卵巢成熟卵泡膜细胞、上皮细胞和颗粒细胞以及子宫内膜上皮细胞、腺上皮细胞、平滑肌细胞存在ERα大量分布，而ERβ主要分布于卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞。
本研究克隆了济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因;获得了特异性兔抗山羊ERs多克隆抗体，使用该抗体建立免疫组化方法检测了济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢及子宫ERs的分布表达，为进一步研究雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。