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随着分子生物学技术的迅猛发展，人们逐渐对神经系统的多种疾病的细胞及分子水平的研究有了越来越深入的认识，这就使得神经系统疾病的治疗有了更多的选择。神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）作为近几年来的研究热点，已经引起越来越多的医护人员关注，因此，对神经干细胞的深入研究为一些神经退行性疾病和神经系统损伤性疾病的治疗带来希望。神经干细胞生存的微环境对其增殖、分化及可塑性有着重要的影响，研究表明，在神经损伤及神经退行性疾病中可见自噬发生。病理条件下细胞可以发生自噬的活化，进而提高细胞器和蛋白的降解水平。但是，如果细胞器与蛋白的降解率不能与生物合成时物质的再利用率达到平衡时，将引起细胞自噬压力的活化。因此，要缓解自噬压力我们需要采取复合式的治疗，不仅要调控自噬的活化程度，还要关注溶酶体的降解效率，使自噬的水平与受损神经元细胞器和蛋白的降解水平保持基本平衡。同时，还应刺激并加速线粒体与其它突起内物质的生物合成，使物质降解与再利用相平衡。这种方式将为神经退行性疾病的治疗奠定基础理论依据。为了深入研究自噬对神经干细胞增殖和分化的影响，本研究以大鼠神经干细胞作为研究对象，研究EGF、bFGF撤除条件下自噬与大鼠神经干细胞增殖和分化的关系。在神经干细胞培养体系中撤除EGF、bFGF，应用透射电子显微镜、二次克隆实验、免疫细胞化学技术、Western Blot等技术观察神经干细胞的超微结构、神经干细胞的增殖、突起的生长及自噬相关蛋白的表达情况。方法(1)分离胎鼠大脑皮质组织细胞，原代悬浮培养形成聚集生长的神经球。(2) Nestin免疫组化染色，NF/GFAP免疫荧光染色鉴定获得的细胞为大鼠神经干细胞。(3) RT-PCR技术检测MAP-2、GFAP等神经元分化标志性基因的表达。(4)采用二次传代的方法计数经二次克隆生成的神经球神经干细胞的数量，观察EGF、bFGF撤除对神经干细胞增殖的影响。(5)利用透射电子显微镜观察撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞的超微结构差异。(6)免疫荧光技术检测撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞的LC3表达情况。(7)Western Blot技术检测撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞凋亡、自噬相关蛋白的表达情况。(8)利用形态学软件测量撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞突起生长情况。结果1.孕14天胎鼠大脑皮质细胞，原代悬浮培养后，经Nestin免疫组化染色，NF/GFAP免疫荧光染色及RT-PCR技术鉴定，成功获得大鼠神经干细胞。2.撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞相比，形成二次神经球的数量明显减少。3.撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞相比，凋亡相关蛋白Bax表达增强。4.撤除EGF、bFGF的神经干细胞与正常培养的神经干细胞相比，Beclin1的表达明显增强。5.透射电子显微镜结果显示，在生长因子缺失的环境中可见自噬泡的出现。6.在EGF、bFGF缺失3天后，大部分神经干细胞细胞仍呈Nestin阳性，但与对照组相比，神经干细胞突起明显增长。7.EGF/bFGF撤除3天，神经干细胞中LC3-II表达明显增强，但在自噬抑制剂3-MA的作用下， LC3-II表达水平有所降低。8.应用自噬抑制剂3-MA分别作用于EGF/bFGF撤除组及对照组，结果发现在EGF/bFGF撤除组抑制了神经突起的生长，而对对照组神经突起的生长没有影响。结论本研究利用胎鼠大脑皮质细胞悬浮培养成功获得大鼠神经干细胞，在EGF、bFGF缺失的情况下，神经球的生长缓慢，但仍具备神经干细胞的特性，与对照组相比，神经干细胞突起明显增长，提示神经干细胞向神经细胞分化。进一步的观察发现，在神经干细胞培养体系中短期撤除EGF/bFGF会激活自噬起始基因Beclin1的表达，同时促进促凋亡相关蛋白Bax的表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进细胞凋亡发生，影响神经干细胞的增殖和分化，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，进一步激活了Beclin1的活化，诱导自噬的发生，而自噬又影响了干细胞的增殖和分化。本研究表明细胞自噬可能参与大鼠神经干细胞的增殖与分化，为进一步研究中枢神经系统疾病的发病机制和治疗手段提供新的线索。