论文部分内容阅读
研究背景急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种以急性非心源性肺水肿和顽固性低氧血症为特征的临床综合征[1],其病情危重,易进展至急性呼吸窘迫综合征,严重威胁患者的生命及其生存质量,尽管目前我国急危重症医学水平已有长足进步,但对于急性肺损伤的认识及治疗仍需进一步深入。其常见的发病原因主要包括严重感染、休克、创伤、烧伤、大量输血等,但随着呼吸机辅助通气在临床上应用日益广泛,机械通气所致肺损伤(ventilator induced lung injury,VILI)逐渐增多并受到越来越多的学者的关注。机械通气所造成的应力损伤,可破坏肺组织内细胞膜结构,炎症因子的大量释放,引起肺损伤[2]。研究证实,肾素一血管紧张素系统(reninangiotensinsystem,RAS)是局部存在于心、肾、脑、肺等组织中,其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为主要效应分子,是由血管紧张素Ⅰ(angiotensin Ⅰ,AngI)在血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的作用下转化而来。RAS系统在急性肺损伤中的作用引起了广泛关注,已有研究证实,机械通气所引起的急性肺损伤与RAS系统的激活密切相关,在应用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂后,急性肺损伤得到不同程度的缓解[3],研究证实,在急性肺损伤病变过程中,局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)可引起组织内氧化应激水平升高从而加对重靶器官的损害[4]。已有研究证实,在机械通气诱导的急性肺损伤过程中,小窝蛋白-1参与其中[7][8]。在机械通气引起的急性肺损伤过程中,肺内RAS系统是否也通过小窝蛋白-1上调氧化应激水平,进而造成细胞和组织的炎性病变,目前尚不清楚。自20世纪50年代由Palade[5]和Yamada[6]首先报道以来,存在于大多数动物细胞质膜表面的细颈瓶样凹陷结构——小窝(caveolin)受到越来越多的学者的关注。研究发现,小窝不仅参与胞内外物质转运,也是细胞表面信号富集和转导的关键结构。根据功能和分布的差异,小窝的结构蛋白可进一步分为caveolin-1(cav-1)、cav-2和cav-3,其中,以cav-1的作用和分布最为广泛、功能最为全面,研究也最为深入。研究证实,cav-1不仅参与急性肺损伤的病变过程,尚可能在其中扮演重要角色。作为细胞膜表面重要的信号调控平台之一,小窝及小窝蛋白cav-1在机械通气所致肺应力性损伤的过程中发挥关键的调控作用[8]。但针对cav-1在急性肺损伤时的具体作用,学术界仍存在较多争议。有学者认为,机械通气过程中cav-1在肺组织内的高表达可发挥明显的抗炎作用[7];而也有研究发现,cav-1可通过由中性粒细胞所介导的炎症反应,参与急性肺损伤的发生和发展[8]。因此,对于cav-1在急性肺损伤过程中发挥抗炎还是促炎作用,目前尚无定论,甚至有部分学者提出:cav-1在急性肺损伤早期发挥促炎效应,而在损伤的晚期则通过抑制肺组织的纤维化而发挥对肺脏的保护作用。NLRP3炎症小体是一个由多种蛋白结合的复合体,由NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)和Pro-caspase-1组成,作为NLRP3炎症小体的核心蛋白NLRP3,对炎症复合体相关组分,如凋亡相关点样蛋白(ASC)和Pro-caspase-1的调控具有重要意义。已有研究发现,在急性肺损伤中,细胞受刺后,ROS生成增多,激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,促进pro-IL-1β、pro-IL-18的切割成熟,炎症因子的释放造成肺组织的损伤[9]。急性肺损伤过程中出现的急性炎症反应,包括毛细血管屏障破坏,通透性增加,大量蛋白的渗出,细胞因子的释放,ROS使肺顺应性下降,非心源性肺水肿、不正常的气体交换,导致严重缺氧[23][24][25][26][27][28]。。本研究拟通过探索呼吸机所致肺损伤小鼠模型中小窝蛋白-1及其相关信号通路的改变,为机械通气所引起的肺损伤的预防和治疗提供新的理论依据。研究目的利用呼吸机过度通气建立小鼠呼吸机性肺损伤模型,并以血管紧张素Ⅱ转换酶抑制剂氯沙坦进行干预,通过检测小鼠肺组织小窝蛋白-1与氧化应激相关蛋白的相互作用、评估组织内氧化应激相关蛋白和炎症相关蛋白的表达情况,探讨氯沙坦通过小窝蛋白-1在呼吸机性肺损伤中的作用机制。研究方法1、动物模型建立:36只成年雄性C57小鼠随机等分为对照组(Control)、单纯氯沙坦给药组(Losartan,LST)、机械通气模型组(Mechanicalventilation,MV)和治疗组(MV+LST)4组,每组9只。单纯氯沙坦给药组及治疗组小鼠按10mg/kg预先行氯沙坦灌胃1周。MV组、MV+LST组小鼠采用机械通气建立肺损伤模型,Control组、LST组小鼠不做处理或单纯应用药物治疗,不进行呼吸机处理。模型建立完成后,脱臼法处死所有小鼠,留取肺泡灌洗液、小鼠肺组织标本以待后续研究使用。2、肺泡灌洗液检测:以BCA检测试剂盒检测所留取的小鼠肺泡灌洗液中蛋白浓度,通过比较不同组间肺泡灌洗液中蛋白浓度的差异判断各组小鼠急性肺损伤的差异情况。3、组织病理学评价:将制备好的小鼠肺组织石蜡标本切片、脱蜡、水化,并进行HE染色,利用Smith评分方法对各组小鼠进行急性肺损伤评分,统计各组小鼠急性肺损伤之间的差异。4、免疫组织化学染色:将制备好的小鼠肺组织石蜡标本行切片、脱蜡、水化、抗原修复等处理后,灭活内源性过氧化物酶、封闭非特异性抗体并以此孵育第一抗体和第二抗体,最后以DAB染液显色、苏木素复染。脱水、封片完成后,以显微镜观察并拍照分析实验结果。5、组织免疫荧光共染:将制备好的小鼠肺组织石蜡标本行切片、脱蜡、水化、抗原修复等处理后,灭活内源性过氧化物酶、封闭非特异性抗体并以此孵育第一抗体和带有荧光信号的第二抗体,最后以DAPI染核并封片。以荧光显微镜观察并拍照分析实验结果。6、蛋白免疫印迹实验:取小鼠左肺组织制备组织匀浆,完成离心、浓度测定及高温变性等步骤后,将混有上样缓冲液的总蛋白提取液加入事先制备好的丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行蛋白电泳,目的蛋白分离后,进一步进行转膜、非特异性抗原封闭以及抗体孵育,完成后以远红外成像仪检测目的蛋白荧光值并进行半定量分析。研究结果1、肺组织病理改变及肺损伤评分:HE染色光学显微镜下观察,对照组及单纯氯沙坦给药组小鼠各级支气管上皮和肺组织内结构完整,肺泡间隔正常,未见明显炎性细胞浸润。机械通气组小鼠肺内可见大量炎性细胞浸润和弥漫性肺间质水肿,肺泡间隔明显增厚,部分肺泡破裂融合,肺泡腔内有血性液体且有炎性细胞浸润。治疗组组小鼠肺内可见部分炎性细胞浸润,肺泡间隔有一定程度增厚,但较机械通气组小鼠组明显减轻。采用Smith评分法评估各组小鼠肺损伤程度,结果显示,相较于对照组及单纯氯沙坦给药组,机械通气组小鼠肺损伤程度明显加重,治疗组小鼠肺损伤程度较机械通气组明显减轻。2、肺泡灌洗液总蛋白含量检测:检测各组小鼠肺泡灌洗液内总蛋白浓度,结果显示,相较于对照组和单纯氯沙坦给药组,机械通气组小鼠肺泡内总蛋白含量明显升高,而治疗组小鼠肺泡灌洗液内总蛋白含量较机械通气组明显减少。3、免疫荧光双染:各组小鼠肺组织免疫荧光染色结果显示,相较于对照组及单纯氯沙坦给药组小鼠,机械通气组小鼠肺组织内NOX4蛋白(绿色荧光标记)与cav-1蛋白(红色荧光标记)间重叠明显增多,提示NOX4蛋白在小窝内发生明显富集,而氯沙坦治疗组小鼠肺组织内,cav-1蛋白荧光亮度减弱,且NOX4蛋白与cav-1蛋白的重叠较机械通气组小鼠明显减少,即提示NOX4蛋白在小窝内富集程度较小。4、免疫组化检测IL-1β含量:检测肺组织内炎症相关蛋白IL-1β在不同组小鼠肺组织内表达情况,结果显示,机械通气组小鼠肺组织内IL-1β蛋白表达较对照组明显升高,而采用氯沙坦治疗组小鼠肺内,机械通气后IL-1β表达较机械通气组小鼠明显减少。5、Western blot检测结果:蛋白免疫印迹实验检测不同组小鼠肺组织内caveolin-1、NOX4、IL-1β、NLRP3、ASC、pro-caspase1、caspase1-p10 等蛋白表达情况。结果显示:小窝蛋白cav-1在机械通气组小鼠肺内明显升高,而采用LST治疗后,机械通气所引起的cav-1蛋白表达明显受到抑制;对氧化应激相关蛋白NOX4的检测显示,机械通气组小鼠肺组织内NOX4蛋白表达较对照组明显升高,LST治疗组小鼠肺组织内NOX4蛋白表达较机械通气组小鼠明显减少;对炎症相关蛋白 IL-1β 以及炎症小体相关组分 NLRP3、ASC、pro-caspase1、caspase1-p10等检测同样显示:机械通气导致小鼠肺内炎症相关蛋白和炎症小体相关组分表达明显升高,而LST治疗可明显减少机械通气造成的小鼠肺组织内炎症因子和炎症小体的表达。研究结论1、在机械通气诱导的小鼠急性肺损伤过程中,小窝蛋白-1、NOX4及NLRP3炎症小体的表达上调,并且密切相关。2、氯沙坦抗机械通气诱导的急性肺损伤作用,与其对小窝蛋白-1、NOX4及NLRP3炎症小体三者的抑制密切相关。