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细胞色素C氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体中重要的能量代谢分子,其功能是进行呼吸链电子传递,即承担着从细胞色素C(Cytochrome c)到氧分子(O2)的电子传递功能,同时催化氧分子还原并偶联质子泵。细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)是COX具有酶催化活性的三个亚基之一,是COX最大最保守的亚基。
青石斑鱼(Epinephelus awoara)属鲈形目,鮨科,石斑鱼亚科,石斑鱼属的海洋珊瑚礁鱼类,是我国海水养殖鱼类中最具经济价值的名贵鱼类之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法,克隆鉴定了青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因。结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5端非编码区3 bp,3端非编码区105 bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9％。
采用RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达。注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(p＜0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化。
细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因由线粒体基因组编码,因编码规则不同于通用遗传密码而很难直接进行外源表达。本研究选取了青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因阅读框367位到720位序列,采用重叠延伸PCR的方法对其中特定碱基(第561位碱基)进行突变改造,然后将突变后的序列与酿酒酵母表达载体pYES3连接,成功构建了重组表达质粒并在酿酒酵母INVSc1中进行了蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示,在12.7 KD处产生特异的表达条带,Western印迹分析验证了其正确表达。