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研究背景：
得益于医学科学的发展进步，人类寿命普遍延长，改善和提高生活质量已逐渐成为众所聚焦的世界性公共卫生课题，而对严重影响生活质量的全球第二位致盲眼病——青光眼，有关研究尽管历时漫长，治疗仍止步于减缓疾病进展，却难以阻止更无法挽救视功能的最终丧失，其关键瓶颈即在于：青光眼的发病机制迄今不明！
现有证据已充分肯定，青光眼实为一类以特征性视神经结构损伤和视野缺损为表现的神经退行性病变，其最终结局是视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、视功能逐渐丧失(Buckingham et al.，2008)。然而，在各种病理条件下，RGCs是如何遭受刺激、进而产生凋亡的？在众多学说中，除压力损伤机制外，视网膜的缺血再灌注(ischemia—reperfusion，IR)损伤机制是另一较为成熟的研究。证据表明，青光眼的病理性高眼压本身可导致视神经供血不足，而各种血管失调节因素均可引起视网膜缺血，导致视神经退行性变，同时激活星形胶质细胞，从而上调谷氨酸等有毒物质的产生，进一步产生毒性作用，同时再灌过程中的氧化压力也会生成过量的自由基，损伤RGCs。因此，我们选择大鼠视网膜IR模型对RGCs凋亡的病理环境进行模拟。
另一方面，近年研究发现，在中枢神经系统广泛存在着一类Ca2+通透的阳离子通道蛋白TRP离子通道家族(Transient receptor potential)。TRP是一类六次跨膜的非选择性阳离子通道(Minke et al.，1977；Montell et al.，1985，2002；Wang et al.，2005，2007)，参与众多重要的生理学功能。近年来在神经科学领域的相关研究得到了深入而系统的发展。在众多TRP通道亚族中，目前研究最多且较为成熟的是TRPC(Transient receptor potential canonical)亚族。现已证实TRPC亚族的成员TRPC6在人的中枢神经系统中表达丰富、功能活跃(Montell et al.，2002；Nilius B et al.，2007；Talavera K et al.，2008)。有关TRPC6通道参与调控细胞存活与凋亡的相关研究表明，TRPC6/ TRPC3对血清剥夺环境下的小脑颗粒神经元的存活具有重要促进作用(Amaral et al.，2007；Talavera Ket al.，2008；Tai et al.，2008a；Jia et al.，2007)，而在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中TRPC3过表达可引起小鼠心肌细胞的凋亡(Shan et al.，2008)。在眼内，已有的文献报道与我们的前期工作均发现，在视网膜上有TRPC6通道mRNA和蛋白的存在(Krizaj，2005；Wimmers et al.，2007)，并且主要分布在视网膜神经节细胞层(Warren et al.，2006)。在具有TRP变异基因的果蝇模型中(Wang et al.，2005，2007)，持续激活的TRP通道可引起视网膜变性；而药理学手段干预TRP通道能够影响细胞凋亡的过程。
综合以上研究结果，本课题立题以青光眼神经性盲的靶细胞—RGCs为研究切入点，选择视网膜IR损伤模型对青光眼RGCs的凋亡病理环境进行模拟，初步探讨TRPC6通道在青光眼RGCs病变中的作用与机制。由于病理刺激和RGCs凋亡中间存在一定的时间距离，为临床治疗干预提供了良好的时机，本研究将通过阐明青光眼的发病机制，为进行临床干预治疗奠定坚实的实验基础，并为进一步治疗青光眼提供新的思路和药物干预靶点，具有一定的现实意义。
本课题的研究主要分为以下三个部分：
第一部分 TRPC3/6在正常SD大鼠视网膜及视网腊神经节细胞上的表达
一、研究目的：
检测正常SD大鼠视网膜中TRPC3/6的表达水平、表达分布，探讨其表达分布的生理学意义。
二、方法与材料：
1.研究对象：
本研究选择正常SD大鼠做为研究对象，选取视网膜组织为检测重点，同时选用脑组织、肾脏组织做为对照。
2.研究方法：
利用反转录多聚酶链反应(RT—PCR)和核酸原位杂交(In situ hybridization，ISH)，检测TRPC3/6在视网膜组织上的基因表达水平及mRNA的分布位置；利用蛋白质免疫印迹(Western blot)和蛋白质免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)方法，检测TRPC3/6在视网膜组织上的蛋白表达水平及蛋白表达的分布位置。预实验决定各项反应所需条件，所有正式试验均由同一试验者在相同条件下完成。
三、结果：
RT—PCR显示，与阳性对照脑组织和肾脏组织相比，在SD大鼠视网膜组织上存在TRPC3/6 mRNA的转录，而Western blot则进一步表明TRPC3/6通道蛋白在SD大鼠视网膜组织上有表达，且TRPC6的基因和蛋白表达量均较高；ISH染色结果显示TRPC6 mRNA在SD大鼠视网膜组织上的表达主要分布在视网膜神经节细胞层，且染色位于细胞浆内，IHC染色结果显示TRPC6蛋白主要分布在视网膜神经节细胞层，在内丛状层有点状着染，内核层和外丛状层也存在少量表达。ISH及IHC的阴性对照基本无非特异染色。
第二部分
TRPC6在SD大鼠视网膜缺血再灌注模型中的表达变化
一、研究目的：
检测TRPC3/6基因转录水平及蛋白表达量在SD大鼠视网膜IR模型中不同再灌时间点的表达变化。
二、方法与材料：
采用视神经血管钳夹法建立视网膜IR模型，夹闭视网膜血供60分钟，分别于再灌注后12小时、24小时、48小时、72小时、7天、14天处死大鼠，提取视网膜总RNA及蛋白，利用RT—PCR及实时荧光定量PCR(Realtime PCR)测定TRPC6基因表达变化，利用Western blot半定量检测TRPC6的表达变化。视网膜缺血时间由预实验决定。
三、结果：
成功建立SD大鼠视网膜60分钟IR动物模型，再灌注的7天内，视网膜缺血将引起一类急性的RGCs死亡，再灌注的7天后，随之引起一类慢性且持久的细胞死亡。Realtime PCR及RT—PCR结果显示TRPC6 mRNA在再灌注后12小时开始出现升高，24小时出现表达高峰；Western blot结果显示TRPC6通道蛋白表达高峰出现于再灌注后24小时，随后表达量开始下降，7天时降至正常表达水平(与正常SD大鼠视网膜表达量做比较)，至2周时TRPC6蛋白表达量降至平均水平的1/2。
第三部分
TRPC6在SD大鼠视网膜缺血再灌注模型中的药理学研究
一、研究目的：
运用TRPC非特异性拮抗剂和激动剂对SD大鼠视网膜IR损伤导致的RGCs死亡进行干预，初步探讨TRPC通道在视网膜IR损伤模型中的功能学特性。
二、方法与材料：
使用荧光金染色对活体SD大鼠RGCs进行逆行标记，在充分标记后(7天至14天)，建立视网膜IR损伤模型，分别于视网膜缺血术前30分钟、术前即刻，术后30分钟，通过玻璃体腔注射TRPC拮抗剂SKF—96365和激动剂OAG对RGCs进行干预，且同时注射溶剂PBS和DMSO做为阴性对照组，分别于再灌后24小时、48小时、72小时、7天处死大鼠，常规心脏灌流取视网膜，平铺后行节细胞计数，对结果进行统计分析。
三、结果：
通过统计分析不同处理组间药理学实验结果显示，在缺血再灌注后7天，注射拮抗剂SKF—96365组较之溶剂PBS对照组，RGCs凋亡轻度增加，但差异并无统计学意义；较之溶剂DMSO组，注射激动剂OAG组显著增加了RGCs的早期存活率。单纯给予溶剂组与未用药组对RGCs存活率影响无明显差别。
结论：
本研究结果显示，正常SD大鼠视网膜上存在TRPC6基因和蛋白的表达，且在视网膜神经节细胞层有选择性高表达，这一结果提示TRPC6可能参与调控RGCs的重要生理功能。在SD大鼠视网膜IR损伤模型中，TRPC6在再灌后24小时出现基因和蛋白表达的高峰，这一高峰说明TRPC6可能做为RGCs的感受器，感受IR损伤的病理刺激，在调控RGCs的存活与凋亡中发挥关键作用；而进一步的药理学实验表明，拮抗TRPC6可增加IR导致的RGCs死亡；而激活TRPC6则显著增加再灌后7天内的RGCs早期存活率。这是首次发现并报道了TRPC6在IR损伤后的表达变化，本研究提示了TRPC6可能参与调控视网膜IR损伤中的RGCs凋亡和存活，激活TRPC6具有早期视神经保护作用。这一发现有助于增进我们对青光眼发病机制的认识和研究，并为今后在临床上进行药物干预和治疗提供新的思路和途径。