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吸烟是牙周炎的主要影响因素,吸烟者牙周炎患病率高,病情重,治疗效果及预后较差。烟草中的尼古丁被证实在牙周组织的破坏过程中发挥重要作用,但作用机制尚不明了。课题组前期研究结果发现：大鼠和人类的牙周组织中存在烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(a7nAChR)的功能性表达,尼古丁作用人牙周膜细胞和实验性牙周炎大鼠后a7nAChR表达升高,这一效应可被特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(a-BTX)所拮抗。ERK1/2通路是各种细胞外刺激信号引起细胞增殖分化的细胞内信息传递的交汇点,有实验证实在牙龈上皮细胞中尼古丁可结合α7nAChR,激活下游ERK信号通路,上调炎性因子的表达。c-Fos作为ERK的下游靶基因,它们互相协同作用,参与了细胞增殖和凋亡的调控。研究证实c-Fos在多种细胞调节破骨细胞分化的过程中起到了极其重要的作用。这些研究成果为我们研究尼古丁在牙周炎发生发展中的作用提供了新的思路：尼古丁作用于人牙周膜细胞膜(hPDLCs)后是否会通过α7nAChR,激活下游ERK1/2信号通路?ERK1/2信号通路激活后其下游c-Fos基因的表达是否同样会升高?本实验拟通过探讨a7nAChR, ERK1/2信号通路及c-Fos在吸烟相关性牙周炎中的相互关系,了解人牙周膜细胞中a7nAChR被尼古丁激活后具体的效应机制，为吸烟相关性牙周炎的防治提供一定的理论依据。实验一改良组织块法培养人牙周膜细胞1材料与方法取12~16岁青少年因正畸拔除的健康无龋第一前磨牙，无菌条件下采用组织块法行原代培养；待组织块周围爬出细胞并增殖到一定密度后，常规传代，第5代细胞用于后续实验。2结果原代培养7天左右，组织块边缘陆续有成纤维样细胞爬出。常规传代，镜下观察第5代细胞，见其呈长梭形，轮廓清晰，贴壁生长，排列呈放射状，胞浆均匀丰满，核仁呈圆形且清晰。3结论体外成功培养人牙周膜细胞，建立用于实验的细胞模型。实验二尼古丁和/或α-BTX对人牙周膜细胞中c-Fos表达的影响1材料与方法选取第5代人牙周膜细胞接种于六孔板，通过反转录PCR实验观察α7nAChR激动剂尼古丁在不同时间和浓度作用人牙周膜细胞后c-Fos mRNA的表达变化。通过RT-PCR及Western blot检测各组细胞在尼古丁（10-5M）和/或α-BTX（10-8M）作用后c-Fos mRNA及蛋白的变化。2结果反转录PCR结果表明：10-4M尼古丁作用于人牙周膜细胞1h后c-Fos的基因表达最高，结果有统计学意义（P<0.05），考虑尼古丁剧毒性，采用10-5M浓度尼古丁用于后续实验。RT-PCR及Western blot结果表明尼古丁（10-5M）作用人牙周膜细胞1h后，明显上调c-Fos mRNA和蛋白表达，而α-BTX（10-8M）可显著拮抗此过程，差异有统计学意义（P<0.05）。3结论根据浓度梯度和时间梯度实验，选取10-5M浓度尼古丁和1小时作为后续实验的实验浓度和时间。进一步证实，尼古丁可能通过作用于α7nAChR调节人牙周膜细实验三ERK1/2信号通路对吸烟相关性牙周炎中c-Fos表达的调控作用1材料与方法选取第5代人牙周膜细胞接种于六孔板，分别给予α7nAChR激动剂尼古丁（10-5M）和/或拮抗剂α-BTX（10-8M），通过Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平。另取相同细胞模型，分别给予尼古丁（10-5M）和/或ERK1/2拮抗剂U0126（10-5M），RT-PCR及Western-blot检测c-Fos mRNA和蛋白的表达情况。2结果实验结果表明：与对照组相比，10-5M尼古丁可使人牙周膜细胞ERK1/2磷酸化水平明显增强，10-8M α-BTX可显著降低这一作用，差异有统计学意义(P<0.05)；ERK1/2拮抗剂U0126可明显拮抗尼古丁对c-Fos活性的升高作用，差异有统计学意义(P<0.05)。3结论ERK1/2通路参与了尼古丁调控c-Fos表达的过程，尼古丁可能通过α7nAChR-ERK1/2-c-Fos通路参与了吸烟相关性牙周炎的发生发展。