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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)在一定条件下引起猪群发生生以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的疾病,严重影响养猪业的发展。细菌肽ABC转运体底物结合蛋白不仅介导细菌将肽类转运进入细胞内提供营养,还参与许多重要的细胞活动,如细胞壁肽代谢循环、生物被膜形成、细胞间信号转导、致病性等。此外,一些肽ABC转运体底物结合蛋白还具有良好的免疫保护性。副猪嗜血杆菌HAPS_RS00465基因编码一种肽ABC转运体底物结合蛋白,为了初步明确该蛋白的免疫保护性,本研究对HAPS_RS00465基因进行了克隆表达,并以小鼠作为动物模型,对重组蛋白的免疫保护性进行了研究。同时,为了初步揭示HAPS_RS00465基因对副猪嗜血杆菌生物学特性产生的影响,本研究构建了HAPS_RS00465基因缺失株,并对基因缺失株的一些生物学特性进行了研究。研究结果如下：1.副猪嗜血杆菌HAPS_RS00465基因的克隆表达本研究以Hps M-3菌株的基因组为模板,PCR扩增其HAPS_RS00465基因,并将该基因克隆至T载体上。经XhoI和ScaI酶切后,将目的基因插入到表达载体pET-39b中。经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定,成功构建了重组表达载体pET-39b-HAPS_RS00465。将重组表达载体转入表达菌BL21(DE3)中进行表达并对重组蛋白进行分离纯化,获得了HAPS_RS00465重组蛋白,分子量大小约70 kDa,与预期重组蛋白理论分子量大小一致。Western blot结果表明该重组蛋白能够与Hps M-3菌柣的兔免血清反应,具有良好的反应原性。2.副猪嗜血杆菌HAPS_RS00465蛋白的免疫保护性将HAPS_RS00465重组蛋白(50μg)与佐剂充分乳化,经背部皮下多点注射免疫小鼠,14d后进行第二次免疫。二免后7d检测抗体水平，结果发现HAPS_RS00465重组蛋白能够诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体,表明该蛋白具有良好的免疫原性。二免后14d用5×LD50(6×109CFU)的Hps M-3活菌经腹腔注射对小鼠进行攻毒。结果测得HAPS_RS00465蛋白免疫组小鼠的存活率为70%(7/10),表明该蛋白有较好的免疫保护性,其免疫保护率达70%,具有作为疫苗候选抗原的潜力。本研究确证了副猪嗜血杆菌的一种新的具有免疫保护性的抗原,为副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的研发奠定了基础。3.副猪嗜血杆菌HAPS_RS00465基因缺失株的构建以Hps EP8菌株作为亲本株,设计引物扩增其HAPS_RS00465基因的上游同源臂U(875bp)、下游同源臂D (865bp)以及pKD4质粒中的卡那抗性盒K (935bp),并将这三个片段通过融合PCR进行连接,获得融合片段UKD (2625bp)。经EcoRI和BamHI酶切后,将融合片段插入到pK 18mobsacB载体中。经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定,成功构建了重组载体UKD-pK18。通过自然转化的方式将重组载体UKD-pK18转化进入Hps EP8菌株中,在含有卡那霉素的TSA培养基上筛选基因缺失株。经PCR鉴定、RT-PCR鉴定、测序鉴定以及极性效应检测,成功构建了Hps EP8菌株的HAPS_RS00465基因缺失株。4.副猪嗜血杆菌HAPS_RS00465基因缺失株的生物学特性革兰氏染色镜检发现HAPS_RS00465基因缺失株主要有长杆状和短杆状,与亲本株没有显著差异。OD600-时间曲线反映出HAPS_RS00465基因缺失株生长速度慢于亲本株,表明HAPS_RS00465基因缺失后对细菌的生长产生了一定的影响。生物被膜实验测得HAPS_RS00465基因缺失株形成生物被膜的量(OD630=0.522)显著低于亲本株(OD630=0.930),表明HAPS_RS00465基因能够影响细菌形成生物被膜的量。用50%健康猪血清处理菌株,测得HAPS_RS00465基因缺失株在50%猪血清中的存活率为5.16%,与亲本株(5.47%)差异不明显,表明HAPS_RS00465基因缺失后对菌株的血清抗性没有影响。实验以小鼠为动物模型,测得HAPS_RS00465基因缺失株LD50=7.03×108CFU,亲本株LD50=6.14×108CFU,结果表明HAPS_RS00465基因缺失株毒力有所降低。以上结果表明,HAPS_RS00465基因的缺失对Hps EP8菌株的生物学特性产生了一定影响,对细菌生物被膜的形成影响尤为显著。本课题为进一步研究HAPS_RS00465基因在副猪嗜血杆菌生长和致病过程中的作用提供了基础。