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水痘是一种急性、高传染性的儿童常见呼吸道传播疾病,由水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)引起。同时VZV也是导致带状疱疹(HZ)的病原体,具有严重的危害性。现今使用的VZV减毒活疫苗株(vOka)是唯一获WHO批准使用的水痘/带状疱疹疫苗株,然而有研究显示,vOka为混合毒株且仍具备感染和潜伏神经系统的能力,可能存在较复杂的安全性隐患。因此,迫切需要发展新型的可消除长期隐患的水痘疫苗株,而VZV关键毒力因子的发现和验证是开展该研究的核心基础。本研究在前期发现VZV ORF7抗原缺失可影响病毒在体外人皮肤中感染的工作基础上通过建立包括人皮肤、胸腺、背根神经节移植人鼠嵌合模型在内的VZV体内外感染模型全面系统评价了ORF7抗原对VZV毒力的影响,为VZV新型减毒株的建立提供重要依据。
本研究引进建立了基于VZV Oka株的细菌人工染色体BAC系统(DY380重组系统),应用该系统构建了ORF7全基因敲除的重组VZV毒株(rOka△7)及其ORF7基因再次恢复毒株(rOka△7R)。体外细胞感染实验显示,上述毒株均可在Mewo细胞和ARPE-19细胞中进行培养。由于目前尚无针对VZV ORF7抗原的检测抗体,本研究表达并纯化了ORF7抗原,免疫小鼠后筛选获得了11株可特异结合ORF7抗原的单克隆抗体以及1株兔多抗。同时,应用连续步移的合成肽鉴定获得了上述单克隆抗体的表位。评价实验结果显示,其中3G11和8H3单抗可很好地应用于ORF7抗原的Western-blotting、免疫荧光检测。同时,本研究应用ORF7单抗在免疫荧光检测中进一步证明了rOka△7中ORF7抗原的成功敲除。
人鼠嵌合小鼠模型是通过在免疫缺陷小鼠上实现人类组织的移植生长,在建立包括VZV在内的重要人类病毒的体内感染模型上具有显著的优势和应用价值,其在模拟真实性、实现长期复制感染上具有突出的综合优势。本研究即分别建立了人皮肤、胸腺、背根神经节(DRG)移植人鼠嵌合模型,并应用小鼠活体成像技术成功建立了可连续追踪VZV感染水平的VZV体内感染模型。应用建立的人鼠嵌合小鼠感染模型研究发现,相比对照组野生型病毒,rOka△7不能在人皮肤中进行感染和复制,不会产生皮肤组织病变:同时,rOka△7也不能在人背根神经节DRG中进行复制,不产生神经组织病变,原位杂交检测不能检测到rOka△7的病毒核酸,同时其也不能感染体外培养的DRG和诱导神经组织细胞。上述研究证明了,ORF7是一个新型的VZV皮肤和神经感染趋向性因子,ORF7敲除可导致VZV同时在皮肤和神经组织中的减毒。
同时,本研究应用人胸腺组织移植人鼠嵌合模型研究发现,rOka△7与未敲除对照病毒均可在人胸腺组织中复制。对分离的人树突状淋巴细胞(DC)的感染实验显示,rOka△7与对照病毒均可感染人DC细胞。这说明,VZV在人T细胞中的感染和复制不依赖于ORF7抗原。由于人淋巴组织的感染是人体对VZV减毒疫苗产生免疫反应的重要组织,rOka△7可感染人T细胞有利于VZV作为免疫原被包括人DC细胞在内的淋巴细胞识别及呈递。上述研究显示了,rOka△7有望成为一种新型皮肤神经减毒候选疫苗。
本研究也初步探索了ORF7的可能作用机制。免疫检测显示,ORF7主要存在于VZV感染后细胞的高尔基体(TGN),也存在于VZV病毒粒子中。同时研究显示,ORF7敲除会在.ARPE-19细胞中影响VZV感染导致的合胞体形成,这表明合胞体的形成可能不仅需要病毒糖蛋白也需要ORF7。
综上所述,本研究通过建立并应用包括人皮肤、胸腺、背根神经节移植人鼠嵌合模型在内的VZV体内外感染模型全面评价了ORF7抗原对VZV毒力的影响,证明了ORF7是一个新型的VZV皮肤和神经感染趋向性因子,ORF7敲除的rOka△7有望成为一种新型皮肤神经减毒候选疫苗,并初步探索了ORF7的可能作用机制,为ORF7功能的深入研究和VZV新型减毒株的建立提供重要基础。