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灵芝(Ganoderma luciderm)属于真菌类担子菌纲多孔菌目多孔菌科植物,两千多年前已记载在汉朝的《神农本草经》。灵芝可用于治疗多种疾病,如高血压、支气管炎、关节炎、神经衰弱、慢性肝炎、肾炎、胃溃疡、免疫紊乱、癌症等。灵芝多糖具有调节人体免疫系统及癌症治疗的功能,并具有特异性免疫增强作用,可以活化巨噬细胞的细胞吞噬能力、提高机体的免疫调节功能。本论文主要从灵芝子实体中提取出灵芝多糖,并通过衍生化的方法制备其衍生物。同时,通过高分子物理方法和生物试验结合研究他们的化学结构、分子量和链构象及其对抗肿瘤活性、抗氧化及基因转染效率的影响。本工作涉及高分子物理、药学及生命交叉学科,是国际前沿领域的之一,并属于交叉学科。本论文的主要创新包括以下几点：(1)制备并筛选出活性较好的硫酸酯化及羧甲基化灵芝多糖,揭示他们抗抗肿瘤活性的机理。(2)首次证明硫酸酯化及羧甲基化灵芝多糖具有抗氧化活性。(3)首次通过季铵化合成了阳离子灵芝多糖,并评价了它的细胞毒性及基因转染效率。本论文主要研究内容和结论概括如下。采用0.9% NaCl水溶液及1M NaOH溶液在不同的温度下依次从灵芝多糖中提取出五种水溶性杂多糖,编号为GL-Ⅰ、GL-Ⅱ、GL-Ⅲ、GL-Ⅳ和GL-V。通过傅立叶变换红外光谱(FT-IR),元素分析(EA),气相色谱(GC),气相色谱-质谱联用(GC-MASS)及核磁共振(13C NMR)分析了其化学结构,同时通过激光光散射(LLS),尺寸排除色谱-激光光散射联用(SEC-LLS)及粘度法表征了它们在溶液的链构象,并通过原子力显微镜(AFM)直接观察了灵芝多糖的链形态。实验结果表明,GL-Ⅰ、GL-Ⅱ和GL-Ⅲ为糖蛋白复合物,其蛋白质含量依次为14.6%、5.7%和3.6%。同时,GL-Ⅰ主要含半乳糖,同时含有少量的葡聚糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。随着提取过程的进行,灵芝多糖试样中葡聚糖的含量逐渐增加,支化度逐渐降低。结果揭示,相对高的支化度并且提高了多糖试样的水溶性。LLS-SEC联用技术和AFM的检测结果证明。GL-Ⅰ、GL-Ⅱ和GL-Ⅲ在25℃下的0.9% NaCl水溶液中为较紧缩的球形链构象,而GL-Ⅳ和GL-V呈现较伸展的柔性链构象。以1M NaOH溶液为提取液,从灵芝子实体中提取了一种水不溶性线性(1→3)-β-D-葡聚糖,编号为GL-Ⅳ-Ⅰ。通过硫酸酯化、羧甲基化、甲基化、羟乙基和羟丙基化将水不溶性多糖转变为五种水溶性灵芝多糖衍生物,编号依次为S-GL、CM-GL、HE-GL、HP-GL和M-GL。他们的取代度依次为0.94、1.18、0.53、0.44和0.74。通过IR、13C NMR、二维核磁共振谱(DQF、HMQC)、黏度法、LLS、SEC-LLS等研究了灵芝多糖及其衍生物的一级结构和二级结构。GL-Ⅳ-Ⅰ及其五种衍生物的重均分子量依次为13.3、10.1、6.3、7.2、5.1和14.1×104。实验结果证明,这几种衍生化反应均为非选择性取代,不同位置的-OH反应活性依次为C-6>C-4>C-2。S-GL和CM-GL在水溶液存在明显的静电排斥效应,而在0.9% NaCl中则表现为正常高聚物的黏度行为,说明其静电排斥效应在0.9%NaCl水溶液中被屏蔽。通过LLS-SEC联用技术表征结果建立Mw和<S2>z1/2二者之间的关系式：<S2>z1／2=KMwa。式中的指数a与高分子的构象有关,原糖GL-Ⅳ-Ⅰ(α=0.47)在25℃下的DMSO溶液中为较紧缩的球形链构象,而五种衍生物在25℃NaCl水溶液呈现较为伸展的柔性链构象,主要归因于侧链基团的空间位阻。通过体内及体外实验研究了S-GL及CM-GL的抗肿瘤活性及抑制肿瘤生长、调控肿瘤细胞周期及促进肿瘤细胞早期凋亡的作用。实验结果表明,引入带电基团硫酸基和羧甲基的灵芝多糖衍生物不仅改善了灵芝多糖的水溶性,同时明显提高了多糖的生物活性。S-GL和CM-GL对S-180肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别为26 and 38μg/mL,硫酸酯化和羧甲基化灵芝多糖在抑制S180肿瘤细胞时具有较低的IC50值,同时可以通过将肿瘤细胞周期抑制在G2／M期。S-GL和CM-GL对小鼠体内移植肿瘤的抑制率分别为55.6%、51.3%,接近5-Fu的抑制率(61.9±3.8)。经过S-GL和CM-GL治疗后,肿瘤生长得到明显的抑制。通过体外培养的方式研究了S-GL及CM-GL对S-180肿瘤细胞早期凋亡的诱导作用。S-GL和CM-GL组肿瘤细胞的早期凋亡百分比依次为17.9±1.98%和14.1±2.67%,明显高于阴性空白对照组的细胞凋亡比例2.57±0.39%。同时体内抗肿瘤免疫组化实验结果表明,S-GL和CM-GL可以提高凋亡促进基因Bax的表达,减少凋亡抑制基因Bcl-2的表达,从而促进S-180肿瘤细胞的凋亡。采用一系列体外试验进行硫酸酯化(S-GL)及羧甲基化灵芝多糖(CM-GL)试样的总体抗氧化能力、邻苯三酚的自氧化抑制作用。同时检测了它对DPPH自由基、羟基自由基、超氧自由基的清除作用抗氧化活性研究。研究表明,S-GL和CM-GL均有着良好的体外抗氧化活性,而S-GL的抗氧化活性要优于CM-GL。为了进一步证明灵芝多糖试样的抗氧化活性,我们还对灵芝多糖衍生物试样在体内的抗氧化活性进行了对比。结果表明,S-GL和CM-GL可以消除传统抗癌药物5-Fu对小鼠免疫的抑制作用,提高小鼠的胸腺及脾脏指数,增强小鼠的免疫调节能力。同时,它们还可以有效的提高小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)及还原性谷胱甘肽(GSH)含量,清除小鼠体内过量自由基,有效对抗自由基对重要脏器的损害。通过季铵盐类阳离子醚化剂3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CHPTAC)在NaOH存在的碱性条件下首次成功制备出阳离子灵芝多糖衍生物QGs。通过IR、13C NMR、EA、LLS对其化学结构及分子量进行了表征。QG5和QG6的分子量依次为27.3、40.1×104。结果表明,该取代反应为非选择性取代,取代度分别为0.43和0.51。灵芝多糖经衍生化后带有较强的正电荷,ζ电位依次为34.2、41.5mv。它们在纯水中表现为明显的静电排斥效应,而加入NaCl后显示正常溶液的黏度行为。QG5和QG6在N／P为1：5时即可与pGL-3 DNA质粒形成稳定的络合物,同时其基因转染效率接近于25 kDa聚乙烯亚胺(PEI)的转染效率。而阳离子灵芝多糖相比PET有更好的生物相容性,有望开发为新一代的基因转染材料。总之,本工作确定了灵芝多糖及其衍生物的结构、分子尺寸及其在溶液中的链构象,评价了他们对抗肿瘤、免疫调剂的生物活性,探讨了其抗肿瘤活性的机理。同时研究了灵芝多糖衍生物的抗氧化活性及基因转染效率方面的功能。本工作为化学与生命科学交叉学科领域的研究提供了有价值的科学数据,而且对促进中国传统中草药发展有着积极的推动作用。