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细菌鞭毛有独特的结构和功能。具有很强的抗原性(H抗原),有利于细菌入侵。鞭毛蛋白可刺激机体产生前炎性因子,在连接天然免疫应答和获得性免疫应答中起重要作用。新城疫(Newcastle disease,ND)是危害养禽业的主要传染病之一,是国际兽疫局(OIE)规定的法定通报疾病。有报道证实,位于NDV囊膜上的F蛋白与病毒的致病性有关,参与病毒穿透、细胞融合,除此之外还具有良好的免疫原性,是NDV主要的保护性抗原。本研究以含有新城疫病毒F48E8株全长的融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594 bp大小的F基因的部分片段。经克隆筛选和测序,构建成原核表达质粒pGEX-6P-1-F。重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F)。经IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测分析表明,F基因在原核表达体系中高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%。Western blot结果显示,在相对分子质量46 KD位置有特异性条带。运用M-肉汤培养鼠伤寒沙门氏菌SL7207获得细菌的鞭毛蛋白。经SDS-PAGE分析表明,获得较纯的鞭毛蛋白。Western blot结果显示,在相对分子质量51KD位置有特异性条带。使用浓度为0.5μg/ml、1μg/ml的去内毒素鞭毛蛋白刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,MΦ)2、4、6h。用细胞总RNA进行RT-PCR扩增,检测β-actin、IL-1β、TNF-α、IL-6基因表达。1.5%琼脂糖凝胶电泳验证鞭毛蛋白在2h时已能刺激细胞表达IL-1β、TNF-α、IL-6基因;0.5μg/ml浓度的鞭毛蛋白已能刺激细胞产生应答,转录IL-1β、TNF-α、IL-6。使用10μg/ml浓度的鞭毛蛋白刺激小鼠腹腔MΦ2 h、12 h,以FACS检测细胞表面F4/80~+-FITC/CD80-biotin,F4/80~+-FITC/CD86-biotin的表达量。结果显示,与2 h相比12 h时细胞表达的CD80,CD86分子明显升高。以10μg/只剂量腹腔注射BALB/c小鼠,分别作用12 h、24 h。分离小鼠脾脏低浮密度细胞(Low-density cell,LDC),FACS检测细胞表面CD11c-FITC/CD40-biotin、CD11c-FITC/CD80-biotin、CD11c-FITC/CD86-biotin的表达量。结果表明,LDC表面CD40、CD86分子在12 h组、24 h组表达量均呈现上升,12 h组较24 h组高。CD80分子未出现明显的变化。选取4h和0.5μg/ml浓度的鞭毛蛋白、F蛋白、鞭毛蛋白+F蛋白刺激小鼠腹腔MΦ。经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证,鞭毛蛋白组和鞭毛蛋白+F蛋白组均能刺激细胞产生明显的前炎性因子应答,而F蛋白刺激细胞产生的前炎性因子应答较弱。分别使用PBS、鞭毛蛋白、F蛋白、F蛋白+鞭毛蛋白、F蛋白+弗氏佐剂以皮下注射方式免疫小鼠,F蛋白的免疫剂量为80μg/只,鞭毛蛋白的免疫剂量为10μg/只。三免后可测得F蛋白+鞭毛蛋白组和F蛋白+弗氏佐剂对F蛋白的抗体效价分别为1:4266和1:7680。对各组小鼠脾脏细胞进行ELISPOT以检测抗原特异IFN-γ和IL-4分泌细胞,结果显示鞭毛蛋白+F蛋白组出现较高量的IFN-γ分泌细胞,同时也出现IL-4分泌细胞。而在F蛋白+弗氏佐剂组中F蛋白诱导的免疫应答处于平衡状态,IFN-γ分泌细胞数与IL-4分泌细胞数相当。