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目的:以miRNA-182在乳头状甲状腺癌组织及细胞中高表达为切入点,拟在组织、细胞和分子水平探讨苦参碱抗乳头状甲状腺癌的潜在分子机制,并在此基础上寻找新的抗分化型甲状腺癌的化疗药物及潜在的诊疗干预靶点,对于提高甲状腺癌的防治水平,改善预后及提高患者生存率具有重要临床意义。方法:1.RT-qPCR检测miR-182在乳头状甲状腺癌组织及细胞中的表达:分别收集乳头状甲状腺癌组织和其对应的正常组织标本,RT-qPCR在组织水平检测miRNA-182-3p和miRNA-182-5p的表达;培养人正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1和人乳头状甲状腺癌细胞TPC-1、BCPAP及K1,在细胞水平检测miRNA-182-3p和miRNA-182-5p的水平。2.抑制miRNA-182-5p,CCK-8检测miRNA-182-5p对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP增殖的影响:用阳离子脂质体分别将抑制miRNA-182-5p的miRNA-182-5p inhibitor和其对照inhibitor NC转入TPC-1与BCPAP细胞,24h后传代培养上述细胞至96孔板,分别于培养的0、24、48和72h用CCK-8试剂盒检测TPC-1与BCPAP细胞的增殖,明确miRNA-182-5p对TPC-1与BCPAP细胞增殖的影响。3.抑制miRNA-182-5p,Transwell迁移实验检测miRNA-182-5p对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP迁移的影响:用阳离子脂质体分别将抑制miRNA-182-5p的miRNA-182-5p inhibitor和其对照inhibitor NC转入TPC-1与BCPAP细胞,24h后传代培养至24孔Transwell迁移板,于培养的48h,用4%的多聚甲醛固定细胞后再用0.1%的结晶紫染色TPC-1和BCPAP细胞,随机取5个视野于光学显微镜下观察TPC-1和BCPAP细胞的迁移并用Image J软件统计每个视野迁移的细胞数目。4.抑制miRNA-182-5p后,流式细胞仪检测miRNA-182-5p对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP凋亡的影响:将对数生长期的TPC-1与BCPAP细胞铺至6孔板,用阳离子脂质体分别将抑制miRNA-182-5p的miRNA-182-5p inhibitor和其对照inhibitor NC转入TPC-1与BCPAP细胞,48h后将TPC-1与BCPAP细胞进行Annexing V-FITC/PI双标染色,流式细胞仪检测两种细胞的凋亡。5.RT-qPCR检测不用浓度苦参碱对miRNA-182-5p表达的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞接种至六孔板,待贴壁后向上述细胞分别加入0、0.25、0.5和1 mg/ml苦参碱干预TPC-1和BCPAP细胞,48h后RT-qPCR检测上述各组细胞miRNA-182-5p的表达水平,明确苦参碱对miRNA-182-5p表达的影响。6.CCK-8检测苦参碱对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP增殖的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞接种至96孔板,待贴壁后向上述细胞分别加入0和0.5mg/ml苦参碱分别培养0、24、48和72h,CCK-8检测苦参碱对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP增殖的影响。7.Transwell迁移实验检测苦参碱对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP迁移的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞接种至24孔Transwell迁移板,待贴壁后向上述细胞分别加入0和0.5mg/ml苦参碱分别培养0、24、48和72h,用0.1%的结晶紫染色TPC-1和BCPAP细胞,随机取5个视野于光学显微镜下拍照观察TPC-1和BCPAP细胞的迁移并用Image J软件统计每个视野迁移的细胞数目。8.流式细胞仪检测苦参碱对乳头状甲状腺癌细胞TPC-1和BCPAP凋亡的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞接种至6孔板,待贴壁后向上述细胞分别加入0和0.5mg/ml苦参碱分别培养0、24、48和72h,用Annexing V-FITC/PI双标染色细胞,流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡。9.筛选最佳的过表达miR-182-5p的模拟物浓度:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞接种至6孔板,用阳离子脂质体分别将过表达miRNA-182-5p的miRNA-182-5p-Mimic和其对照Mimic-NC转入TPC-1与BCPAP细胞,48h后RT-qPCR检测上述各组细胞miRNA-182-5p的水平,筛选一个最佳过表达miRNA-182-5p的模拟物浓度用于后续实验。10.过表达miRNA-182-5p,检测苦参碱对TPC-1和BCPAP细胞增殖的影响:用阳离子脂质体分别将过表达miRNA-182-5p的miRNA-182-5p-Mimic和其对照Mimic-NC转入TPC-1与BCPAP细胞,24h后传代培养上述细胞至96孔板,待贴壁后加入0和0.5mg/ml的苦参碱,分别于培养的0、24、48和72h用CCK-8试剂盒检测TPC-1与BCPAP细胞的增殖。11.过表达miRNA-182-5p,检测苦参碱对TPC-1和BCPAP细胞迁移的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞用阳离子脂质体分别将过表达miRNA-182-5p的miRNA-182-5p-Mimic和其对照Mimic-NC转入TPC-1与BCPAP细胞,转染24h后,传代培养上述细胞至24孔Tranwell板中,待贴壁后加入0和0.5mg/ml的苦参碱,于培养的24h用0.1%的结晶紫染色TPC-1和BCPAP细胞,随机取5个视野于光学显微镜下观察TPC-1和BCPAP细胞的迁移并用Image J软件统计每个视野迁移的细胞数目。12.过表达miRNA-182-5p,检测苦参碱对TPC-1和BCPAP细胞凋亡的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞用阳离子脂质体分别将过表达miRNA-182-5p的miRNA-182-5p-Mimic和其对照Mimic-NC转入TPC-1与BCPAP细胞,转染24h后加入0和0.5mg/ml的苦参碱,于培养的24h用Annexing V-FITC/PI双标染色细胞,流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡。13.过表达miRNA-182-5p,Western Blot和RT-qPCR检测苦参碱对TPC-1和BCPAP细胞ERK磷酸化水平、Caspase3、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin和Vinmentin表达的影响:取对数生长期的TPC-1和BCPAP细胞用阳离子脂质体分别将过表达miRNA-182-5p的miRNA-182-5p-Mimic和其对照Mimic-NC转入TPC-1与BCPAP细胞,转染24h后加入0和0.5mg/ml的苦参碱继续培养24h后,检测ERK磷酸化水平、Caspase3、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin和Vinmentin的表达。14.慢病毒的感染实验:分别用慢病毒将过表达miRNA-182的Lv-miRNA-182和其对照Lv-NC导入TPC-1细胞,RT-qPCR在细胞水平检测miRNA-182-5p的表达;15.裸鼠异位移植瘤实验:分别将过表达miRNA-182-5p的TPC-1细胞和其对照细胞接种至裸鼠,实验分为四组:Lv-NC、Lv-miRNA-182、Lv-NC+苦参碱和Lv-miRNA-182+苦参碱组,每组5只裸鼠,每只裸鼠右侧后背皮下注射200ul的细胞悬液,Lv-NC+苦参碱和Lv-miRNA-182+苦参碱组的裸鼠在注射感染了Lv-NC和Lv-miRNA-182的TPC-1细胞24h后,按50mg/kg/day的量腹腔注射苦参碱,Lv-NC和Lv-miRNA-182组的裸鼠仅腹腔注射等量PBS缓冲液,于接种后的6周,(1)小动物活体成像检测瘤体的大小及转移;(2)留取瘤体、肝肾和心脏组织,HE染色观察上述组织的形态学变化;(3)免疫组织化学染色检测上述四组瘤体组织Caspase3和Bcl-2的表达;(4)RT-qPCR检测上述四组瘤体组织miRNA-182-5p的表达;(5)全自动生化分析仪检测上述四组裸鼠肝功、肾功和心激酶指标。结果:1.RT-qPCR检测的结果显示:甲状腺乳头状癌组织miRNA-182-3p和miRNA-182-5p异常的高表达,但miRNA-182-3p的表达无统计学意义,miRNA-182-5p的表达有显著地统计学意义(P<0.01);与正常甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1相比,miRNA-182-5p在乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1、BCPAP和K1中均显著地升高,且有统计学意义,而miRNA-182-3p只在TPC-1细胞中升高的有统计学意义,在BCPAP和K1细胞中虽然升高,但无统计学意义。因此,本论文着重探讨miRNA-182-5p在乳头状甲状腺癌进展中的作用及苦参碱抗肿瘤活性的分子机制。2.CCK-8实验结果显示:在24h,与对照组相比,下调miRNA-182-5p的表达并没有显著地抑制TPC-1和BCPAP细胞的增殖。在48和72h,下调miRNA-182-5p的表达显著地抑制TPC-1和BCPAP细胞的增殖。3.Transwell实验结果显示:抑制miRNA-182-5p的表达,降低了穿过transwell小室的TPC-1和BCPAP细胞数目。与对照组相比,有显著地统计学意义。4.流式细胞仪检测结果显示:抑制miRNA-182-5p的表达,能显著地诱导TPC-1和BCPAP细胞的凋亡。5.与0 mg/ml的苦参碱组相比,0.5和1mg/ml的苦参碱能够显著地抑制TPC-1和BCPAP细胞miRNA-182-5p的表达(P<0.01);但与0.5mg/ml的苦参碱组相比,1mg/ml的苦参碱抑制miRNA-182-5p表达无统计学上的差异,故选用0.5mg/ml用于后续实验。6.在苦参碱干预的24、48和72h,与0mg/ml的苦参碱相比,0.5 mg/ml苦参碱均能明显地抑制TPC-1和BCPAP细胞的增殖。7.与0 mg/ml的苦参碱相比,0.5 mg/ml的苦参碱处理TPC-1和BCPAP细胞24、48和72h后,穿过Transwell小室的细胞数目均有显著地差异(P<0.01);且苦参碱抑制BCPAP细胞的迁移具有时间依赖性。8.苦参碱能够诱导TPC-1细胞的早期凋亡和晚期凋亡,并且诱导的晚期凋亡细胞所占的百分比大于早期凋亡细胞所占的百分比;对于BCPAP细胞,在苦参碱处理的24、48和72h,主要诱导了BCPAP细胞的晚期凋亡,对BCPAP细胞的早期凋亡影响不明显,无统计学意义。9.60nM的miRNA-182-5p-mimic能有效地外源性过表达miRNA-182-5p,故将该浓度用于后续实验。10.过表达miRNA-182-5p,部分减弱了苦参碱对TPC-1和BCPAP细胞增殖与迁移的抑制作用;也部分抑制了苦参碱诱导TPC-1和BCPAP细胞的凋亡。上述结果提示苦参碱至少部分通过下调miRNA-182-5p的表达抑制了乳头状甲状腺癌的恶性生物学行为。11.与0min相比,在苦参碱处理TPC-1和BCPAP细胞15min、30min和6h均能明显的抑制TPC-1和BCPAP细胞ERK的磷酸化水平。12.苦参碱能明显地提高凋亡执行分子Caspase3和促凋亡分子Bax的基因与蛋白表达,降低抗凋亡分子Bcl-2的基因和蛋白表达。13.苦参碱能明显地抑制N-cadherin和Vinmentin的表达,促进E-cadherin的表达。14.过表达miRNA-182-5p,部分减弱了苦参碱抑制TPC-1和BCPAP细胞ERK磷酸化水平、抑制Bcl-2、N-cadherin和Vinmentin表达,促进Caspase3、Bax和E-cadherin表达的作用。15.体内实验结果显示:(1)苦参碱部分通过下调miRNA-182-5p的表达发挥抑制乳头状甲状腺癌细胞TPC-1的体内成瘤作用,且苦参碱抑制TPC-1细胞体内成瘤主要是通过诱导TPC-1细胞的凋亡,主要表现在苦参碱干预组瘤体组织Caspase3的表达上调,Bcl-2的表达下调;(2)与对照组的瘤体组织相比,苦参碱处理组瘤体组织miRNA-182-5p的表达显著地降低。结论:1.细胞水平的实验结论苦参碱下调人乳头状甲状腺癌细胞miRNA-182-5p的表达、抑制乳头状甲状腺癌细胞的增殖与迁移、诱导其凋亡;其作用的机制可能是与其下调miRNA-182-5p的表达,进而抑制乳头状甲状腺癌细胞ERK的磷酸化水平、抑制Bcl-2、N-cadherin和Vinmentin的表达,促进Caspase3、Bax和E-cadherin的表达有关。2.动物水平的实验结论苦参碱在动物水平发挥抗乳头状甲状腺癌的作用与其下调miRNA-182-5p的水平,进而诱导乳头状甲状腺癌细胞的凋亡、抑制瘤体组织Bcl-2和促进Caspase3的表达,最终抑制乳头状甲状腺癌细胞的体内成瘤有关。