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脑胶质瘤（Glioma）是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,因侵袭性强致使其较难通过手术治疗完全切除,且术后易复发。小胶质细胞（Microglia）是脑胶质瘤微环境的重要组成部分,在脑胶质瘤的侵袭过程中发挥重要作用。小胶质细胞可塑性强,可受脑胶质瘤微环境中许多因素的影响极化为功能截然不同的两大类,即具有抑制脑胶质瘤增殖侵袭作用的M1型和具有促进脑胶质瘤增殖侵袭作用的M2型。近年来二甲双胍（Metformin,Met）抗肿瘤的效应功能受到研究者的广泛关注,但对二甲双胍抗脑胶质瘤的研究大多集中在对肿瘤细胞本身,尚缺乏其对肿瘤微环境中小胶质细胞作用的研究。本研究以脑胶质瘤的治疗为出发点,对二甲双胍抑制脑胶质瘤微环境中小胶质细胞的M2型极化,进而影响脑胶质瘤的侵袭作用进行探讨,具体研究分为以下四部分:第一部分 二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化[目的]通过经典方法分别构建小胶质细胞M1和M2型极化模型,并初步探讨二甲双胍对小胶质细胞M1和M2型极化的影响。[方法]（1）借助脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）分别诱导BV-2小胶质细胞M1和M2型极化模型,通过镜下观察细胞形态改变、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）检测 M1（iNOS、CD86、TNF-α）和 M2（Arg-1、YM1、FIZZ1）型特异标记基因转录水平变化和蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测 M1（iNOS、IL-6）和 M2（Arg-1、CD206、IL-10）型特异标记蛋白表达水平变化以确定小胶质细胞极化模型构建情况。（2）采用CCK-8实验筛选二甲双胍刺激BV-2细胞的适宜浓度;在LPS诱导的M1型极化模型上,采用qRT-PCR和WB方法分别检测二甲双胍作用下BV-2细胞M1型极化模型特异标记物的表达情况,以观察二甲双胍对小胶质细胞M1型极化的影响。（3）在IL-4诱导的M2型极化模型上,采用qRT-PCR、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和WB方法分别检测二甲双胍作用下BV-2细胞M2型极化模型特异标记物的表达情况,以观察二甲双胍对小胶质细胞M2型极化的影响。[结果]（1）镜下显示空白组静息态的BV-2细胞突起细长呈长条状,而经LPS和IL-4诱导后的M1和M2型极化细胞突起均明显缩短,形似阿米巴虫,M2型比M1型突起更少,胞体更圆,且特异标记物转录和表达水平均明显升高,与既往研究结果描述的诱导型M1和M2型极化模型一致。（2）选定无明显细胞毒性的1mM为后续二甲双胍作用浓度;qRT-PCR和WB实验显示二甲双胍对M1型特异性标记物的转录和表达水平均无明显影响。（3）二甲双胍作用于BV-2细胞M2型极化,qRT-PCR实验显示其M2型特异标记基因Arg-1、YM1、CD206、FIZZ1、CCR2、IL-10的转录水平下降,IF和WB检测显示M2型特异标记蛋白Arg-1和CD206表达量下降,且不同实验方法所检测M2型极化标记物的变化基本一致。[结论]LPS和IL-4可分别诱导静息态小胶质细胞形成M1和M2型极化模型;二甲双胍对LPS诱导小胶质细胞M1型极化无明显作用;二甲双胍抑制IL-4诱导小胶质细胞M2型极化。第二部分 二甲双胍通过抑制小胶质细胞M2型极化抑制脑胶质瘤侵袭[目的]分别采用体内外实验探讨二甲双胍通过抑制小胶质细胞M2型极化进而抑制脑胶质瘤的侵袭作用。[方法]（1）通过IL-4和二甲双胍单独或共同作用于BV-2细胞后制备条件培养基（Conditioned Medium,CM）,CCK-8和细胞凋亡（流式法）实验分别检测CM对脑胶质瘤GL261细胞增殖和凋亡的影响,通过伤口愈合、Transwell、酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和 WB 实验检测 CM 对脑胶质瘤细胞侵袭功能的影响。（2）分别借助氯磷酸盐脂质体（Clodronate liposome,Clo）和立体定向仪建立SD大鼠的颅内去小胶质细胞和脑胶质瘤模型,首先通过磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）和苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检查成瘤情况,通过IF检测小胶质细胞特异标记物Iba-1以观察去小胶质细胞模型构建情况,然后通过ELISA检测促肿瘤侵袭因子CCL-2和IL-10的表达水平,最后通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和WB实验检测M1型、M2型和侵袭标记蛋白的表达情况。[结果]（1）CCK-8和细胞凋亡实验显示1mM二甲双胍作用下BV-2细胞M2型极化对脑胶质瘤GL261细胞的增殖和凋亡无明显影响,细胞划痕和Transwell侵袭实验显示二甲双胍作用下BV-2细胞M2型极化的促脑胶质瘤细胞侵袭能力下降,ELISA结果提示二甲双胍作用下BV-2细胞M2型极化CM中促脑胶质瘤侵袭因子CCL-2和IL-10分泌减少,且WB结果显示不同CM作用下肿瘤细胞的侵袭相关标记蛋白MMP2和MMP9表达水平显著差异。（2）MRI、HE和IF结果提示SD大鼠立体定向颅内脑胶质瘤和去小胶质细胞模型构建成功,ELISA实验提示二甲双胍下调样本血浆中BV-2细胞M2型极化相关促脑胶质瘤侵袭因子CCL-2和IL-10的表达,IHC实验提示二甲双胍明显抑制侵袭标记蛋白MMP2和MMP9的表达,WB实验显示二甲双胍对M1型极化无明显作用,明显抑制M2型极化和侵袭标记蛋白的表达,上述ELISA、IHC和WB实验在Clo去除小胶质细胞后抑制作用均明显减弱,提示小胶质细胞M2型极化在此过程中发挥重要作用。[结论]二甲双胍通过抑制小胶质细胞M2型极化抑制脑胶质瘤的侵袭。第三部分二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化中部分差异表达RNAs分析[目的]为了探讨相关RNAs在二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化中的表达特点,我们引入转录组测序方法和生物信息学技术分析,从转录组的层面出发为第四部分研究二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化的分子机制奠定基础。[方法]（1）以IL-4诱导的M2型极化模型作为对照组,联合给予1mM二甲双胍干预作为实验组,各组随机选择3瓶相同处理的样本进行转录组测序,筛选差异表达的circRNAs、miRNAs和mRNAs,并借助qRT-PCR完成部分显著差异表达RNAs 的初步验证。（2）借助 GO（Gene Ontology,GO）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析、PPI（Protein-protein Interaction,PPI）和MCODE筛选关键基因、ceRNA网络构建的生物信息学技术对测序所得显著差异表达RNAs进行分析。[结果]（1）依据P＜0.05和|log2Fold Change|＞1的标准对所得测序结果中的差异表达RNAs进行筛选,得到显著差异表达的circRNAs 15个、miRNAs 10个、mRNAs 8个。选取部分显著差异表达的上调基因Dusp8、Bche、Sgpp2、circ-001083、miR-1966-3p和下调基因Jam2、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA Desaturase 1,SCD1）、F13a1、circ-010517、circ-005090、miR-6933-3p、miR-3110-5p完成qRT-PCR验证,其结果同测序结果基本一致,说明本研究的测序结果可靠性强。（2）通过生物信息学技术对显著差异表达RNAs完成分析:KEGG富集分析结果包括胰岛素分泌、白细胞跨内皮迁移、血管平滑肌收缩、细胞粘附、坏死性凋亡、AMPK等分子通路,SCD1富集于二甲双胍的常见作用通路AMPK;PPI方法构建包括SCD1和Arg-1的由84个节点和96条边组成的蛋白互作图,其中,MCODE筛选得到1个显著Module及9个关键基因;最终构建由33条circRNA-miRNA-mRNA轴组成的ceRNA网络,其中的miR-1966-3p/SCD1引起重点关注。[结论]二甲双胍作用下M2型极化小胶质细胞部分RNAs发生显著差异表达,且miR-1966-3p/SCD1/AMPK可能在此过程发挥重要作用。第四部分二甲双胍通过miR-1966-3p/SCD1/AMPK抑制小胶质细胞M2型极化[目的]通过第三部分的转录组测序和生物信息学技术分析得到部分显著差异表达的RNAs,本部分旨在进一步探讨miR-1966-3p/SCD1/AMPK是否在二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化过程中发挥重要作用。[方法]（1）采用qRT-PCR和WB检测IL-4诱导下BV-2细胞M2型极化中miR-1966-3p、SCD1转录及表达水平的改变。（2）借助SCD1抑制剂和过表达质粒干预,通过WB检测SCD1、P-AMPK/AMPK、M2型极化标记蛋白的表达情况,以对SCD1/AMPK参与二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化过程进行探讨。（3）采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-1966-3p和SCD1之间的结合作用。（4）分别借助 miR-1966-3p-inhibitor 和 miR-1966-3p-mimics 进行干预,通过qRT-PCR实验检测miR-1966-3p和SCD1转录水平的变化,并通过WB方法检测SCD1、P-AMPK/AMPK、M2 型极化标记蛋白的表达情况,以对miR-1966-3p/SCD1/AMPK参与二甲双胍抑制小胶质细胞M2型极化过程进行探讨。[结果]（1）IL-4诱导下BV-2细胞M2型极化中miR-1966-3p的转录水平明显降低,SCD1的转录和表达水平均明显升高。（2）SCD1抑制剂同二甲双胍具有协同作用,均可使SCD1和M2型极化标记蛋白表达下降,P-AMPK/AMPK表达升高;而过表达SCD1抑制了二甲双胍处理对BV-2细胞M2型极化的上述作用。（3）双荧光素酶基因报告实验结果提示miR-1966-3p与SCD1可以直接靶向结合。（4）miR-1966-3p-inhibitor质粒下调miR-1966-3p后,SCD1的转录和表达水平均上调,P-AMPK/AMPK表达下降,M2型极化标记蛋白表达升高,联合Met或SCD1抑制剂后上述作用均消失;miR-1966-3p-mimics质粒上调miR-1966-3p后,SCD1的转录和表达水平均下调,P-AMPK/AMPK表达升高,M2型极化标记蛋白表达下降,联合Met后上述作用无明显变化,而联合SCD1过表达质粒后上述作用消失。[结论]二甲双胍通过miR-1966-3p/SCD1/AMPK抑制小胶质细胞M2型极化。