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目的:探讨局部亚低温对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其作用机制。方法1实验分组及动物模型的制备32只SD雄性大鼠,体重200～250 g(河北医科大学实验动物中心提供)。随机分为4组,每组8只。假手术组(S组):分离并暴露双侧颈总动脉,开颅并暴露基底动脉第二无血管区,仅穿线不阻断;缺血/再灌注组(I/R组):采用3血管(双侧颈总动脉和基底动脉)阻断法建立全脑缺血/再灌注损伤模型,缺血10 min,再灌注6 h;亚低温组(H组):再灌注前即刻经股静脉缓慢注射10℃生理盐水3.5 ml,结合头部冰块降温,60 W白炽灯照射身体,监测鼓膜温度和直肠温度。再灌注前体温维持正常,再灌注后1 min内鼓膜温度降至并维持在32～34℃,直肠温度同时降低,20 min左右升至并维持在37.5～38.7℃,低温维持3 h,3 h后60 W白炽灯照射身体缓慢复温;5-羟葵酸盐+亚低温组(5-HD + H组):缺血前30 min腹腔内注射1 mg/ ml线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-羟葵酸(5-HD)10 mg/kg,其它3组腹腔内注射等容积生理盐水。脑缺血前5 min、脑缺血10 min、再灌注后10 min采集股动脉血检测动脉血氧分压和动脉血二氧化碳分压。2标本的采集及检测方法2.1大鼠血清S100B蛋白浓度的检测于再灌注6 h,水合氯醛腹腔注射再次麻醉大鼠,采集颈内静脉血样2 ml,于37.5℃恒温水箱中水浴30 min后,以半径8 cm、以转速3500 r/min离心10 min,取血清,置于液氮罐中保存备用。严格按照大鼠血清S100B蛋白酶联免疫试剂盒说明书的要求测定出各种浓度的标准品的吸光度,并绘制标准曲线、求得回归方程。采用ELISA法检测出血清S100B蛋白的吸光度,根据回归方程求得S100B蛋白浓度。2.2大鼠脑水含量的测定断头法处死大鼠,完整取出脑组织,去除中脑及脑桥,留取左侧大脑组织,用滤纸吸干表面水份后置于干燥小瓶中,-20℃冰箱保存备用。用干(110℃24h烘干)、湿重法计算脑水含量,作为脑水肿程度的判断。计算方法:脑水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100 %。2.3大鼠脑组织匀浆MDA含量和SOD活性的测定取右侧脑组织,-20℃冰箱保存。用PBS缓冲液制备10 %脑组织匀浆,严格按照试剂盒说明书的要求采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定脑组织匀浆MDA含量和SOD活性。2.4光镜观察皮质神经元的病理学改变在冰盘上取右侧大脑额叶同一部位,切取厚度为3 mm,面积5 mm×5 mm组织块,冷盐水冲洗干净后置于4 %多聚甲醛中摇匀,室温下过夜,在10×40光镜下观察皮质神经元的病理学改变。2.5透射电镜下观察皮质神经元线粒体的超微结构右侧大脑半球额叶同一部位按照“快、小、轻、准”四字原则在冰盘上切取1mm×1mm×1mm的组织块。于4 %戊二醛固定液中,4℃冰箱中保存。固定1h以上后送电镜实验室,在透射电镜下观察皮质神经元线粒体的超微结构。结果1各组间体重、脑缺血前5 min、脑缺血10 min、再灌注后10 min血气指标比较差异无统计学意义。2各组间脑组织匀浆SOD活性的比较S组SOD活性为68±10 U/mg prot ;I/R组为29±6 U/mg prot ;H组为51±6 U/mg prot ;5-HD + H组为44±4 U/mg prot。与S组比较,I/R组SOD活性降低(P < 0.05);与I/R组比较,H组SOD活性升高(P < 0.05); 5-HD + H组SOD活性与H组比较降低,与I/R组比较升高(P < 0.05)。3各组间血清S100B蛋白浓度、组织含水量及脑组织匀浆MDA含量的比较S组血清S100B蛋白浓度为0.01±0.00μg/ L,组织含水量为( 78.4±1.2 ) % , MDA含量为1.98±0.11 nmol/mgprot;I/R组血清S100B蛋白浓度为0.86±0.35μg/ L ,组织含水量为(85.8±1.4)%,MDA含量为4.0±0.14 nmol/mgprot ;H组血清S100B蛋白浓度为0.42±0.07μg/ L,组织含水量为(80.1±1.6)%,MDA含量为2.51±0.24 nmol/mgprot ;5-HD + H组血清S100B蛋白浓度为0.64±0.06μg/ L ,组织含水量为(82.2±1.7)%,MDA含量为3.37±0.18 nmol/mgprot。与S组比较, I/R组S100B蛋白浓度、组织含水量、MDA含量升高(P < 0.05);与I/R组比较,H组S100B蛋白浓度、组织含水量、MDA含量降低(P < 0.05); 5-HD + H组S100B蛋白浓度、组织含水量、MDA含量与H组比较升高,与I/R组比较降低(P < 0.05)。4光学显微镜观察皮质神经元的病理学改变光镜观察到:S组神经细胞形态结构正常,胞浆丰富、均匀淡染,核圆形或椭圆形,核仁明显; H组大部分神经细胞轻度皱缩、结构基本正常,核椭圆形,核仁清楚,其间有少许嗜伊红神经细胞,细胞周围轻度水肿; 5-HD + H组损伤范围扩展,大量神经细胞固缩,嗜伊红性,尼氏体分解,核浆分界不清,核仁不清,细胞周围中度水肿,见于大脑皮质全层; I/R组损伤范围进一步扩展,神经细胞严重固缩深染,尼氏体消失,核浆溶合,细胞周围高度水肿。电镜观察到:S组神经细胞形态结构正常,线粒体少部分嵴融合或消失;I/R组细胞质明显水肿,线粒体大部分或全部嵴、部分或大部分膜融合或消失;H组细胞质有轻度水肿,线粒体部分嵴和膜融合或消失;5-HD + H组细胞质水肿,核膜水肿,线粒体部分和大部分嵴和膜融合或消失。总的来看:S组损伤最轻,I/R组损伤最重,H组和5-HD + H组损伤程度介于两者之间,其中H组损伤明显减轻。结论局部亚低温对全脑缺血/再灌注损伤大鼠有保护作用,机制可能是与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关。