论文部分内容阅读
轮状病毒属于呼肠弧病毒科轮状病毒属,是感染婴儿和幼畜,导致严重腹泻的主要病原体之一,包括7个不同组(A-G),其中A组轮状病毒是感染人和动物的主要类型。每年因轮状病毒感染导致约500,000婴幼儿和大量幼畜死亡,花费了巨大的医疗资源,并造成畜牧业严重的经济损失。研究开发一种安全、有效的轮状病毒疫苗具有重要意义。
病毒样颗粒(Virus-like Particles,VLPs)广泛用于诊断和疫苗测试等领域,因此低成本、高产量获得VLPs是目前研究的重点。已有的研究都是利用AcNPV在st9细胞中生产VLPs,成本高且产量低。本研究在MA104细胞中培养繁殖了牛轮状病毒,提取病毒RNA并RT-PCR扩增得到了结构蛋白基因vp2、vp4、vp6、vp7,DNASTAR分析了各基因的核苷酸和氨基酸序列,比较了各基因在病毒传代过程中的遗传稳定性;构建分别携带vp2、vp6、vp7的转移载体,同时引入由IEⅠ启动子驱动的绿色荧光蛋白基因以检测感染效率,重组得到了能同时表达这三个基因的BmMultiBac,并转染BmN细胞组装了轮状病毒样颗粒;为了避免因某种蛋白合成量不足,导致不能高效组装出完整的VLPs,研究增加vp6和vp7基因拷贝数对病毒样颗粒组装量的影响,构建了含不同拷贝数基因的转移载体,可引入不同比例基因至BmMultiBac,从而更高效地组装轮状病毒样颗粒,为低成本高效率生产VLPs这种候选疫苗奠定了基础,同时也对利用杆状病毒表达系统生产其他重组蛋白提供了借鉴意义。
结果表明,扩增得到的vp2含有完整的ORF,编码880aa,与NCBI中牛轮状病毒UK株核酸序列相似性为98.6％,氨基酸序列相似性为97.6％,变异较大;vp4基因含有一个2331bp的ORF,编码776aa,与UK株核酸序列相似性为98.2％,氨基酸序列相似性为99.2％,仅存在几个碱基的不同;vp6基因编码397个aa,核酸和氨基酸序列相似性分别为98.1％、98.5％;vp7编码327aa,序列相似性分别为99.1％和98.8％;可见vp2在病毒传代过程中发生了较多的突变,其他三个基因的遗传稳定性更好。
vp2、vp6和vp7基因分别连接到了转移载体上,构建了转移载体pFBDM-vp6/7/zg及pUCDM-vp2,分别通过Tn7和Cre-LoxP重组将外源基因整合至BmMultiBac中,转染BmN细胞组装轮状病毒VLPs。通过ELISA检测vp7基因3-端携带的6xHis标签证实vp7基因的表达,细胞切片的电镜观察证实得到了VP6形成的约45nm管状结构和约50nm的轮状病毒VLPs。成功构建了含不同拷贝数基因的pFBDM-vp2/6/7、pFBDM-vp6/7/zg、pUCDM-vp6/7、pUCDM-vp2、pMT-vp6/7/zg转移载体,可用于研究拷贝数对VLPs组装量的影响。
本研究是利用家蚕杆状病毒多基因表达系统在BmN细胞中高效组装轮状病毒样颗粒,三种转移载体可同时向BmMultiBac引入多至10个基因,从而可在昆虫细胞内表达含更多抗原蛋白或不同血清型抗原的VLPs,对于生产安全、多效价的疫苗具有重要意义。本研究还将重组的BmBultiBac注射至家蚕幼虫,并观察到了绿色荧光蛋白的表达,为利用家蚕生物反应器低成本、高效率生产VLPs奠定了基础。