玫烟色拟青霉对小菜蛾致病性及机理研究

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玫烟色拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,寄主和分布广泛。本文以小菜蛾为材料,从致病性、培养条件、致病机理等方面对从烟粉虱上分离的玫烟色拟青霉Pf020菌株进行了研究。主要结果如下: 1 36个拟青霉菌株以玫烟色拟青霉菌株Pf020对小菜蛾的毒力最高。第三天时,Pf020菌株对小菜蛾2龄和3龄幼虫的致死中量分别为8.318×105孢子/mL,2.428×106孢子/mL。在浓度为1×107孢子/mL时,致死中时间分别为1.82天,2.31天。25℃时,Pf020对小菜蛾2龄和3龄幼虫的毒力最高,致死中量分别为1.297×105孢子/mL,7.731×105孢子/mL。Pf020菌株对小菜蛾3龄幼虫具有生长发育抑制作用,2天的抑制率为93.6%。 2 DPA(2,6-吡啶-二羧酸)毒素对小菜蛾2龄和3龄幼虫具有拒食活性。DPA毒素对2龄幼虫的选择性拒食中浓度和非选择性拒食中浓度分别为8.6mg/mL,26mg/mL。DPA毒素对3龄幼虫的选择性拒食中浓度和非选择性拒食中浓度分别为3.6mg/mL,12mg/mL。第三天时,DPA毒素对2龄和3龄幼虫触杀活性的致死中量分别为9.137mg/mL,20.68mg/mL。DPA浓度为10mg/mL,第二天的毒素对小菜蛾3龄幼虫的生长发育抑制率为55.4% 3 玫烟色拟青霉及粗毒素对小菜蛾羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、酚氧化酶(PO)的活性影响试验结果证实:小菜蛾在玫烟色拟青霉处理后前3天,CarE的活力比对照的要高。之后,小于对照的活力。这说明,真菌感染小菜蛾后,能提高小菜蛾CarE的活力。DPA粗毒素处理后,小菜蛾CarE的活力下降,第4天处理的酶活力开始大于对照的酶活力。小菜蛾感染玫烟色拟青霉后,其谷胱甘肽-S-转移酶的变化规律基本同对照相同,这说明,其对小菜蛾谷胱甘肽转移酶的影响较小。DPA粗毒素处理小菜蛾后,谷胱甘肽转移酶的活力持续下降,这说明,DPA粗毒素能够有效抑制其活性。小菜蛾单酚氧化酶在小菜蛾感染玫烟色拟青霉后第3天,第4天,与对照相比,其酶活升高,这说明,真菌提高了小菜蛾幼虫单酚酶的活力。粗毒素对单酚酶的影响不甚明显。由玫烟色拟青霉对小菜蛾二酚氧化酶的活性测定可知,其处理的酶活性一直小于对照的酶活性,这说明,小菜蛾感染玫烟色拟青霉后,其二酚氧化酶的活性受到显著抑制。而粗毒素对二酚氧化酶的活性影响甚微。 4 玫烟色拟青霉的胞外蛋白酶活力较高,且产酶较迅速,在接种后第1天既能发现酶的活性。其蛋白酶能够在低温和较高温度下保持活性。前3天,虫粉培养基蛋白酶活性与小菜蛾死亡率几率值的相关性较高,线性方程为Y=0.6305X+3.1222,R2=0.7703。蛋白酶的最适温度为35℃,40℃时略有下降,45℃时,酶的活性已较低。其最适pH值为8,在近中性时,蛋白酶能保持较高的活性。几丁质可以诱导几丁质酶的产生,在加有几丁质的诱导培养基中,几丁质酶的产生比虫粉培养基要早。玫烟色拟青霉几丁质酶的最适温度是45℃,随温度升高,几丁质酶的活性急剧下降。其最适pH值为6,在偏酸性环境中具有较好的活性。当pH值大于9小于4时,活性较低。在天然温度下,淀粉酶和脂肪酶活性不明显,与昆虫的毒力关系不紧密。 5 小菜蛾感染玫烟色拟青霉后,能引起昆虫总血细胞数量的变化。具体数量变化规律为,在昆虫刚刚受到侵染时,主要会引起颗粒血细胞和浆血细胞的数量短暂上升,造成总血细胞数量的上升。当小菜蛾幼虫濒临死亡时,小菜蛾总血细胞数量锐减,颗粒血细胞的数量锐减。珠血细胞内的珠形内含物数量也出现减少趋势,直接造成珠血细胞的体积减小。小菜蛾血淋巴在感染玫烟色拟青霉后,血淋巴中可以发现少量的菌丝段,血淋巴中的各种类型的血细胞都不同程度的破损,死亡。对血淋巴进行PAGE电泳分析,发现感病小菜蛾的蛋白带明显减少,变弱。只剩下迁移率为0.42和0.38两条蛋白带,其余的蛋白带已消失。 6 通过在Czapek培养基中增添或减少某种化合物,考察几种大量元素和微量元素对生长和产孢的影响,结果证实:大量元素N,P,K,Mg,S对生长和产孢的影响比较大,其中,以N,P,K影响最大,缺失三种元素明显抑制生长和产孢。在微量元素中,以Zn对生长和产孢的促进最为显著,Cu的抑制作用最为明显。通过正交试验证实,四个因素对菌丝生长的影响重要性依次为:通气量(C),转速(A),培养基(D);接种量(B)。最优组合为C1A3D2B23。对产孢的影响按照极差大小依次为培养基(D),通气量(C),接种量(B),转速(A)。最优组合为D3C1B3A2。对DPA含量的极差依次为通气量(C),转速(A),培养基(D),接种量(B),最优组合为C1A3D2B2。
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