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研究目的:造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)在血液系统恶性疾病和非血液系统疾病中有着广泛应用,但移植后的移植物抗宿主病(GVHD)仍是移植相关死亡的首要原因,限制了其应用。早在1966年Billingham提出了GVHD发病的三个要素:(1)移植物中含免疫活性细胞;(2)受体表达供体没有的组织抗原;(3)受体处于免疫抑制状态不能排斥移植物。大量研究发现,虽然去除移植物中的T细胞或抑制其功能均能使GVHD的发生率或其严重程度降低,但却增加了机会性感染及复发的几率。近几年,具有免疫调节作用的细胞调控GVHD成为新的研究热点,如间充质干细胞、NK细胞、NK T细胞、CD4+CD25+Tregs等,它们通过抑制供者的同种反应性T细胞对非己抗原的免疫攻击,从而使GVHD的发生降低,但是上述细胞的缺点是它们的获得、扩增等均需要特殊的条件及设备,限制了其在临床中广泛应用。另外一些研究报导,受者自身的某些细胞如骨髓细胞、外周血单个核细胞、脾细胞同样可以有效地降低GVHD的发生,而具有取材方便、易于获得、安全性高、便于直接应用等优点的受者淋巴细胞受到人们重视。本实验旨在研究MHC半相合小鼠造血干细胞移植后,不同时间输注不同数量的受者脾细胞,对GVHD的产生、发展的影响,并进一步的探讨其可能机制。研究内容:1,MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立2,移植后不同时间输注不同数量的受者脾细胞对植入及GVHD发生的影响3,移植后+4d输注受者脾细胞3×107,降低GVHD发生率的机制探讨研究方法:1.MHC半相合小鼠造血干细胞移植GVHD模型的建立将受体小鼠根据输注细胞数量的不同随机分为4组,每组用8只小鼠。将实验分为A组:单纯8Gy TBI预处理。B、C、D三组:预处理相同(8Gy TBI照射),分别输注供鼠脾细胞量为1×107、3×107、6×107,A组仅输注等量的生理盐水。在移植后,监控造血恢复情况、供体嵌合情况、受鼠的体征变化及组织病理学改变,并进行GVHD的评分和诊断。2.移植后不同时间输注不同数量的受者脾细胞对植入及GVHD发生率的影响根据移植后的时间及输注受者细胞的数量,将实验分组为(1)移植后+1d输注组:在移植后+1d(以移植C57BL/6动员后脾细胞输注当天,作为第0天,下同)给予受鼠脾数量分别为1×107、3×107、6×107,对照组输注等量生理盐水。(2)移植后+4d输注组:在移植后+4d给予受鼠脾细胞数量分别为1×107、3×107、6×107,对照组输注等量生理盐水。(3)移植后+7d输注组:在移植后+7d输注受鼠脾细胞数量分别为1×107、3×107、6×107,对照组输注等量生理盐水。在移植后监控造血恢复情况、供体嵌合情况、受鼠的体征变化及组织病理学改变,并进行GVHD的评分及诊断。3.移植后+4d输注受者脾细胞3×107,降低GVHD发生率的机制探讨在移植后+1d、+4d、+7d输注等量受者细胞3×107,在移植后,监控外周血的淋巴亚群比例变化和T淋巴细胞FasL的表达变化。研究结果:1,受鼠CB6F1给予8Gy TBI预处理,输注MHC半相合亲代供鼠C57经G-CSF动员后的脾脏单个核细胞,在输注细胞数量为1×107时,虽然受鼠能达到完全供者嵌合状态,但GVHD发生率仅为50%。而在输注细胞数量为3×107、6×107时,受鼠均能够形成完全供者嵌合,其GVHD发生率为100%,受鼠脾脏、小肠、皮肤、肝脏的病理结果呈现出典型的GVHD病理改变,表明成功的建立了H-2半相合小鼠Allo-HSCT移植物抗宿主病动物模型。2,在移植后+1d分别输注受者细胞数量为1×107、3×107的移植组,供体均获得完全嵌合状态(complete chimerism,CC),其GVHD发生率和死亡率均为100%,中位生存时间为18d~21d,而输注6×107组,却导致了移植排斥,移植受鼠全部因造血衰竭而死亡,中位生存时间为14d;在移植后+7d时,分别输注受者细胞量1×107、3×107、6×107的移植组,供体均获得CC,其GVHD发生率和死亡率均为100%,中位生存时间为23d~28d;而在移植后+4d时输注受者细胞量为3×107、6×107的移植组,供体均获得CC,其GVHD发生率在20%~30%,显著降低了GVHD的发生率,中位生存时间>60d,显著延长受者存活时间;而在移植后+4d时输注1×107组,GVHD的发生率为80%,中位生存时间为45d。3,在正常供鼠(C57)中,CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为(0.3±0.06)%、(0.4±0.11)%。在移植后+10d,阳性对照组(8Gy TBI输注供者细胞3×107)中外周血供者CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率为(72.12±19.05)%、(36.23±15.73)%,显著高于正常供鼠的表达(P<0.05)。而在+4d输注组(移植后+4d输注受者细胞3×107)中CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表达率分别为(10.14±7.26)%、(6.12±5.75)%,显著低于阳性对照组,具有统计学差异(P<0.01),与+1d输注组(移植后+1d输注受者细胞3×107):CD3+CD4+FasL:(51.52±11.12)%、CD3+CD8+FasL:(13.13±3.35)%比较P<0.05,与+7d输注组(移植后+7d输注受者细胞3×107):CD3+CD4+FasL:(68.16±13.25)%、CD3+CD8+FasL:(36.14±9.64)%比较P<0.01,具有显著性差异。研究结论:1,本研究成功建立了H-2半相合小鼠移植GVHD动物模型,为进一步研究GVHD的机制提供了理想的平台;2,在MHC半相合小鼠造血干细胞移植后+4d时输注受者细胞能显著降低GVHD发生率,延长生存时间;而在移植后+1d、+7d时,并不能降低GVHD发生率。3,MHC半相合小鼠造血干细胞移植后输注受者脾细胞,输注的时间不同,会导致T淋巴细胞的表面FasL的表达呈现出不同的状态。受者细胞在移植后+4d输注比+1d、+7d输注能更明显的降低T淋巴细胞FasL的表达。