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目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小RNA(small RNA,sRNA),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的sRNA,其基因位置和表达特性都已经在前期研究中得到论证,本论文拟对该小RNA在伤寒沙门菌中的相关功能进行探究。方法:1.T64高表达菌株的制备。根据前期研究获得的sRNA T64基因序列,在转录起始端和终止端处分别设计上下游引物,扩增获得编码T64的基因片段,经Nco I和Hind III双酶切,与同样双酶切的质粒pBAD/Myc-His A定向连接,并导入大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆,从中提取重组质粒电击导入伤寒沙门菌野生株,作为sRNA T64高表达菌株。2.在hfq基因缺陷株中高表达T64。提取携带编码T64的基因片段的重组质粒,电转导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷株,在hfq基因缺陷株中诱导T64高表达。3.T64高表达菌株生长曲线测定。将T64高表达菌株和空质粒对照株分别在TSB中振荡培养,每隔1 h检测1次菌液的OD600值,连续测量10 h。以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,比较T64高表达菌株和空质粒对照株的生长情况。4.T64高表达菌株的动力实验。将T64高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD600 0.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5 h,以诱导T64表达,分别取T64高表达菌株和空质粒对照株的1μl菌液点种于含0.3%琼脂糖的LB或TSB半固体培养基,37°C培养12 h后测量动力圈直径,比较细菌的动力。5.实时荧光定量pcr检测基因转录水平。细菌经过培养后,以trizol法提取总rna,用特异性引物进行逆转录及实时荧光定量pcr,分析野生株在不同培养基中培养时t64的表达差异,以及t64高表达菌株中生物膜形成相关靶基因的转录水平变化。6.生物膜形成实验。将细菌培养至对数期(od6000.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5h,以诱导t64表达,取菌液接种于96孔板,30°c静置4天,结晶紫染色后570nm比色定量。7.刚果红实验。过夜培养的t64高表达菌株和空质粒对照株菌液离心收菌,用pbs重悬菌体沉淀并调节菌量一致。滴种5μl重悬液到刚果红平板上,28°c静置3天,观察菌苔形态。结果:1.酶切、pcr验证和序列分析结果显示,成功构建阳性重组载体pbad-t64,并将其导入s.typhi野生株,成功制备srnat64高表达菌株(wt+pbad-t64)。2.pcr验证结果显示,伤寒沙门菌hfq基因缺陷株中成功导入了pbad-t64,即菌株Δhfq+pbad-t64制备成功。3.生长曲线结果表明,在一定时间内,t64高表达菌株生长速度明显快于空载体对照株。4.动力实验表明,在tsb半固体培养基中,t64高表达菌株的动力较空质粒对照株稍稍减弱;而在lb半固体培养基中,两者动力几乎无差别。5.荧光定量pcr结果显示,野生株在lb和tsb两种培养基中培养时t64的表达量有差异,在tsb中t64的表达量明显升高;在t64高表达菌株中,生物膜形成相关靶基因fimy、pilp、stcb和stgd转录均上调。6.生物膜形成实验结果显示,t64高表达菌株的生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复;hfq基因缺陷株即使高表达T64也难以形成生物膜。7.刚果红实验结果显示,T64高表达菌株和空质粒对照株都只能形成光滑和白色的菌苔,未展现出与生物膜形成对应的菌落形态。结论:伤寒沙门菌小RNA T64的表达受到培养条件的影响,高表达T64后能促进细菌的生长,并且能在一定程度上抑制细菌的动力。T64有助于伤寒沙门菌形成生物膜并促进生物膜形成相关基因的表达,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。