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牛乳头瘤(Bovine Papillomatosis, BP)是由牛乳头瘤病毒(Bovine papillama-virus， BPV)引起牛的一种以体表或部分黏膜慢性增生性肿瘤为特征的疾病，在世界各地均有报道。目前，BPV可分为14个基因型，还有众多未被分类的假定基因型。不同基因型BPV可引起不同部位的病理变化，且BPV具有很强的种属特异性，很难感染除宿主以外的其他动物。近年来，贵州省大力发展养牛业，不断从国内外引进优良的品种牛，牛养殖规模不断扩大。2015年镇宁县某养牛场发生了疑似牛乳头瘤病病例。为了解牛乳头瘤病毒在贵州省的流行情况，本实验开展了贵州省牛乳头瘤病毒病原学感染情况调查、BPV贵州流行株基因分型与BPV1贵州株全基因组测序，并对其L1基因进行生物信息学分析和原核与真核表达研究，以期为牛乳头瘤病诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。 1．贵州地区牛乳头瘤病毒感染情况调查及基因分型 为了弄清贵州地区养牛场BPV感染情况及其病毒基因型，本研究采用发病情况调查、临床症状观察、病理切片观察、PCR检测和分子分型等方法，对贵州省发病养牛场32份疑似牛乳头瘤病例进行感染情况调查及基因分型，结果显示：患病牛的体表瘤体多呈结节状或菜花状，颜色多呈灰白色；组织病理学观察可见瘤体呈现角质化过度和细胞空泡化现象；在32份疑似病料中均可检测出BPV，其中检出BPV1有2份(占6.25%)、检出BPV2为28份(占87.50%)和检出BPV13有2份(占6.25%)。由此可见，在疑似牛乳头瘤病例中均有BPV感染，其中BPV2为贵州地区牛感染的主要基因型。 2．牛乳头瘤病毒1型贵州株全基组克隆及相关序列分析 为了解BPV1贵州株全基因组结构特征及遗传变异情况，本研究根据GenBank上BPV1参考株设计7对特异性引物，以贵州六枝患病牛皮肤肿瘤DNA提取物为模板进行PCR扩增、克隆与测序和拼接分析，结果显示：7对引物均可扩增出相应的DNA片段，其大小分别为1248 bp、1461 bp、846 bp、817 bp、1475 bp、1488 bp和985 bp；经拼接获得BPV1贵州株全基因组大小为7946 bp，A+T含量为54.73%，G+C 含量为45.27%，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5、L2和L1 8个开放阅读框，具有典型的BPV1基因组结构特征；进化树分析显示其与BPV2、BPV13和BPV14进化关系较近。 3．牛乳头瘤病毒1型贵州株L1基因生物信息学分析 为了解牛乳头瘤病毒1型贵州株L1基因分子特征和预测编码蛋白生物学功能，本研究选取BPV1贵州株L1基因序列，应用生物信息学相关软件及方法进行分析，结果显示：BPV1贵州株与BPV1参考株的核苷酸和氨基酸同源性最高，分别为99.8%和100%；与BPV2、BPV13和BPV14参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性较高，分别为84.3%、85.5%、73.4%和92.1%、92.7%、80.6%；与BPV2、BPV13、BPV14同属于Delta属；经预测，BPV1贵州株L1基因编码蛋白二级结构以无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋区域为主，存在多个抗原表位，无跨膜区域和信号肽区域，是一种非分泌蛋白。这些研究结果为BPV1 L1基因的表达研究提供理论依据。 4．牛乳头瘤病毒1型贵州株L1衣壳蛋白表达研究 为了解BPV1贵州株L1基因在原核细胞和真核细胞中的表达情况，本研究首先将L1基因连接入pCold I载体，转化至BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE与Western Blotting进行反应原性鉴定；然后将L1基因克隆入pEGFP-C1，转染MDBK细胞，通过荧光显微镜观察和Western Blotting鉴定；原核表达产物经His-tag镍柱亲和层析法纯化，免疫家兔制备多克隆抗体，结果显示：L1基因能在原核细胞上得到良好的表达，表达产物的分子质量约为55.6 kD，且以包涵体形式存在，表达蛋白能与His标签抗体发生特异性反应；L1基因真核表达质粒转染MDBK细胞后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，且该真核表达产物能与GFP标签抗体发生特异性反应；家兔制备的多克隆抗体能与L1基因表达产物发生特异性结合。这些结果为探索以BPV1 L1基因为靶标开展BP基因免疫研究奠定了坚实的基础数据。 综上所述，本研究首次证实了贵州地区牛存在BPV感染并确定其基因型，获得BPV1贵州株全基因组序列，构建了BPV1 L1基因的原核表达质粒pCold I-BPV1-L1和真核表达质粒pEGFP-BPV1-L1并成功表达，且获得了兔抗BPV1 L1多克隆抗体。