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近年来，蛋白多肽类药物因其高性能和高选择性而成为了许多疾病的首选治疗策略，尤其是在糖尿病、感染性疾病等重大疾病的治疗中显示出巨大的潜力。蛋白多肽类药物的口服给药具有许多突出的优势，引起了人们的广泛关注。但这类药物口服后面临许多屏障，主要包括1）酶屏障:消化道内有许多蛋白水解酶，能以协同作用方式迅速水解蛋白多肽，使其失活;2）黏液屏障:高黏弹性的肠黏液阻滞了药物分子及药物载体到达上皮细胞，限制药物被进一步吸收;3)上皮细胞屏障:上皮细胞间的紧密连接及细胞膜限制强亲水性、分子量大的蛋白多肽类药物的跨膜转运。胃肠道内多重屏障的综合作用导致蛋白多肽类药物口服吸收困难，游离药物口服生物利用度往往低于1％，难以达到理想的疗效。 首先，本文针对酶与黏液屏障，设计了一种新型的冠状核壳纳米粒(CSC)，以改善其黏液穿透性及提高药物分子在胃肠道中的稳定性，进而提高模型药物胰岛素的口服吸收。采用薄膜分散水化——挤膜的方法制备CSC，所得CSC粒径为195.3nm，zeta电位为-4.3mV，裸露的CSC的内核心——壳聚糖纳米粒(NC)的zeta电位为+36.6mV。透射电镜(TEM)观察CSC为类球形结构，粒度分布均一，呈现典型的核壳结构，可见明显的内核心NC与外层脂质膜的分界，该结果与电位逆转共同证实了核壳结构的形成。体外实验研究表明，CSC在模拟肠液(SIF)和模拟胃液(SGF)中均能稳定存在，其核壳结构能够显著提高位于内核心的模型药胰岛素在含酶环境中的稳定性。 以荧光素标记的胰岛素（Alexa488-Ins）为荧光探针，以能分泌黏液的HT29MTX(E12)为细胞模型，采用共聚焦z-stack断层扫描模式，通过三维重构，直观考察了NC和CSC在E12细胞表面黏液中的分布。研究结果表明，CSC和NC均能显著提高Alexa488-Ins在黏液中的浓度，且NC和CSC的作用机制不同。裸露的NC通过电荷吸附等机制与黏液产生强黏附作用，滞留在黏液中;而CSC在黏液中具有良好的扩散性，能够顺利穿透黏液，提高细胞表面的药物浓度，进而提高其被E12细胞吸收的机率。定量分析结果表明CSC和NC处理组，分别在完整E12单层（黏液+细胞单层）中检测到初始给药剂量9.3％和4.3％的Alexa488-Ins，其中在E12细胞单层中的胰岛素分别为5.4％和0.5％。 在体吸收研究进一步证实回肠黏膜表面的黏液限制了NC的促吸收效果，CSC能够通过改善其黏液穿透性而提高胰岛素在回肠绒毛的吸收。采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠为实验动物模型进行了药效学和药动学研究，结果表明荷载胰岛素的CSC(50IU·kg-1)灌胃给药后其降血糖效果显著强于等剂量的NC和胰岛素溶液灌胃给药组，血糖最低可降至初始值的50％，而NC组血糖最低仍高于初始值的70％。药动学研究结果证实CSC能显著提高胰岛素在整体动物水平的吸收，灌胃给药的相对口服生物利用度是皮下注射胰岛素生理盐水溶液的7.8％，相比裸露的壳聚糖纳米粒，提高了近2.1倍。 其次，本文还针对上皮细胞吸收屏障，为解决传统微纳米载体跨膜转运效率低的问题，尝试设计能利用肠黏膜内源性细胞转运系统的主动转运纳米载体，以实现高效的跨膜转运，提高胰岛素的口服吸收。本文首次发现了在肠黏膜病理微环境下组成叶酸内源性主动转运系统的叶酸受体和转运体的代偿性上调，并针对这些代偿性表达上调的叶酸受体和转运体，设计了叶酸修饰的主动转运纳米复合物(FNP)，考察其用于改善胰岛素膜渗透性，克服上皮细胞屏障的可行性。首先合成了叶酸共价修饰的壳聚糖，并与胰岛素、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)自组装形成纳米复合物(FNP)。所得FNP粒径为216.7nm，zeta电位为+28.5mV，包封率为81.5％，载药量为41.4％，TEM下观察FNP呈现类球形的纳米颗粒，粒度分布较均一。 采用Caco-2细胞单层模型考察了FNP的入胞及其转运过程，研究结果表明，FNP显著提高了胰岛素的膜渗透性，细胞摄取显著高于未经修饰的壳聚糖纳米复合物(NP)。细胞转运研究表明，FNP所荷载的胰岛素Papp为4.16×10-6cm/s，对比游离胰岛素和NP，分别提高了18倍和2倍。当Caco-2细胞单层实验前用过量的游离叶酸处理后，FNP与NP之间不再有显著性差异，表明叶酸主动转运途径参与了FNP的吸收过程。采用各种内吞抑制剂研究了FNP的内吞途径，研究结果表明FNP以能量依赖的方式被Caco-2细胞内吞，除了小窝蛋白介导的内吞途径和大胞饮途径，可能还有一些特殊的内吞途径也参与了其内吞过程，而NP主要通过网格蛋白介导的内吞途径和大胞饮途径进入细胞。 采用荧光定量PCR(Q-PCR)和Western-blot等生物学技术证实了肠黏膜糖尿病病理微环境下质子偶联叶酸转运体(PCFT)、叶酸受体(α-FR)和还原性叶酸载体(RFC)在糖尿病大鼠中mRNA水平和蛋白水平表达的上调。其中α-FR的上调最为显著，在十二指肠、空肠、回肠三个肠段mRNA水平的上调量均超过了一个数量级，PCFT分别提高了3.2、12.3、7.5倍，而RFC则提高了2.2～3.6倍不等。FNP(30IU·kg-1)灌胃给药后，降血糖效果突出，给药2h后STZ糖尿病大鼠的血糖显著下降，4h后血糖低于初始值的55％，并一直持续至给药后12h。此外，体内药动学研究表明FNP显著提高了胰岛素在STZ糖尿病大鼠体内的口服吸收，其相对生物利用度是皮下注射的9.5％。 本文针对蛋白多肽类药物口服吸收的多重屏障，一方面设计并制备了黏液穿透性能良好的冠状核壳纳米粒(CSC)，以克服黏液屏障和酶屏障，另一方面发现了有利于药物吸收的肠黏膜糖尿病病理微环境特征——代偿性上调的叶酸转运体和受体，并设计了具有高转运效率的叶酸修饰纳米复合物(FNP)，探究了这两种策略用于克服蛋白多肽类药物口服吸收屏障并提高其口服吸收的可行性及其作用机制。该项工作为蛋白多肽类药物口服给药载体的设计与研究提供了一些新思路与新方法。