【摘 要】
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大白菜作为我国重要蔬菜作物,其产量受根肿病的影响极为严重。为研究大白菜对根肿病的抗病机制,本课题组前期研究中通过差异蛋白质组分析在大白菜根系中筛选到一个根肿菌侵染后显著上调表达的自噬蛋白BrAtg6,拟南芥中Atg6基因的缺失加快了根肿菌的侵染进程。为研究大白菜BrAtg6蛋白抵抗根肿菌侵染的作用机制。本研究以大白菜根肿病抗/感近等基因系为试验材料,通过荧光定量分析BrAtg6在不同侵染时期的基因
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大白菜作为我国重要蔬菜作物,其产量受根肿病的影响极为严重。为研究大白菜对根肿病的抗病机制,本课题组前期研究中通过差异蛋白质组分析在大白菜根系中筛选到一个根肿菌侵染后显著上调表达的自噬蛋白BrAtg6,拟南芥中Atg6基因的缺失加快了根肿菌的侵染进程。为研究大白菜BrAtg6蛋白抵抗根肿菌侵染的作用机制。本研究以大白菜根肿病抗/感近等基因系为试验材料,通过荧光定量分析BrAtg6在不同侵染时期的基因表达量;通过亚细胞定位分析了BrAtg6的基因表达部位;利用MDC染色的方法对大白菜根部进行自噬结构的观察;构建酵母双杂文库,并通过酵母双杂从文库中筛选与BrAtg6互作的蛋白;通过在线软件STRING预测与BrAtg6互作的蛋白;最后利用酵母双杂一对一互作检验BrAtg6与这些互作蛋白的互作关系。得到如下结果:1.以抗/感材料不同侵染时期根、茎部cDNA为模板对BrAtg6进行基因表达量分析,结果表明根肿菌侵染后,感病材料中无论在侵染或发病时期的根、茎部位都显著提高,随着发病程度的加重,在根部表达量上调倍数最为显著。抗病材料中侵染时期的接菌材料根、茎中该基因的表达量均显著高于未接菌对照,但发病时期,根、茎中的该基因受接菌的影响不大。说明大白菜可能通过内部调控提高该基因的表达量进而抵抗根肿菌的侵染,抗/感材料中该基因的反应时期有异。2.构建含GFP的过表达载体pBWA(V)BS-BrAtg6-gfp,亚细胞定位结果显示GFP空载在共聚焦显微镜下激光信号分布到细胞质、细胞核等多个部位,而目的基因仅在细胞核处发散荧光信号与DAIP核染料相结合。由此可见目的基因定位于细胞核中。3.对抗/感病材料发病期的根系和同时期的对照根系切片进行MDC染色后激光共聚焦显微镜观察,发现根肿菌侵染后,自噬信号加强。感病材料中随着接菌时间延长,自噬信号加强,自噬信号集中在根肿菌侵染部位,信号异常强烈。而抗病材料中,自噬信号未局限在被侵染部位,而是向侵染点外围扩展,说明抗病材料中通过自噬过程限制了程序性细胞死亡的衍生。4.提取侵染期抗/感病材料的根系RNA构建酵母双杂文库。得到文库滴度为4.0x10 ~7 cfu/mL的合格文库。构建pGBKT7-BrAtg6诱饵载体进行酵母文库筛选,筛选得到42种互作蛋白,其中包括出现次数较多的转录因子相关蛋白(24次);电压阴离子通道相关蛋白(18次);与自噬基因相关的重要蛋白突触素A相关蛋白(14次);钙依赖性脂结合蛋白(11次)以及自噬相关蛋白(7次)。5.以与自噬基因相关的重要蛋白突触素A蛋白Bra031157、钙依赖性脂结合蛋白Bra028148以及自噬蛋白VPS34为主要研究对象,经一对一共转验证了这些蛋白均与BrAtg6存在互作。综上所述,大白菜自噬蛋白BrAtg6在抵抗根肿菌侵染的过程中可能通过细胞自噬与钙离子转导途径共同介导植物的防御系统。
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