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背景和目的:结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是世界第三大恶性肿瘤,也是导致癌症相关死亡的第四大原因。肿瘤复发及远处转移是CRC患者死亡的主要原因,而肝脏是其远处转移最常见的靶器官。大量研究证实,结直肠癌肝转移（Colorectal LiverMetastasis,CRLM）在伴有慢性肝病的患者中发病率较低。对于病理性肝病影响CRLM确切分子机制仍有争议。微小RNA（miRNA）,作为一种内源性非编码RNA,在转录后水平调节人类近60%基因（尤其是癌基因）的表达。miRNA let-7超家族由12个成员组成,它作为一种肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中（包括CRC）发挥重要作用。前期研究已表明,IFN-γ刺激CRC细胞系HT29能下调let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p（let-7a簇）表达,增强其对Fas介导凋亡的敏感性。本文旨在进一步探讨肝炎微环境中IRF-1介导IFN-γ下调CRC细胞let-7a簇表达并降低其肝转移能力的相关分子机制。研究方法:采用4-6周雄性BALB/c小鼠,以40%四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）灌胃法构建慢性肝炎模型,经脾静脉注入鼠源性结直肠癌细胞系CT26.WT构建CRLM模型。活体成像和肝组织H&E染色确立成模时间。ELISA法检测炎症模型肝组织和血清中IFN-γ,TNF-α和IL-1β等炎症因子的表达水平。慢病毒稳转,构建IFN-γ受体1（IFNGR1）敲低细胞系（shRNA-IRFGR1-CT26）,并在肝炎模型的基础上构建转移瘤模型,明确IFN-γ在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。IFN-γ刺激CRC细胞HT29和CT26.WT,体外模拟炎症微坏境,qRT-PCR、Western blot和IHC检测炎症状态下CRC细胞和小鼠肝组织中干扰素调节因子（IRF-1/IRF-2）及let-7a簇表达变化。检索UCSC网站,确立IRF-1/2与let-7a簇表达调控的相关性。Rescue实验、ChIP和双荧光素酶报告基因等实验,阐明IRF-1调控let-7a簇表达可能的相关机制。慢病毒构建let-7a-1-5p敲低（shRNA-let-7a-1-5p-CT26）和高表达（LV-let-7a-1-5p-CT26）细胞株,在正常和炎症小鼠模型基础上构建转移瘤模型,研究let-7a簇对结直肠癌肝转移的影响,同时探索其在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。用qRT-PCR、Western blot和IHC法检测CRC在体内外炎症微环境及let-7a-1-5p低表达情况下EMT相关marker（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的表达情况,探索上皮-间质转化在炎症抵抗肿瘤转移过程中的作用。结果:1、肝炎微环境影响结直肠癌肝转移CCl4灌胃法和脾静脉注射法构建肝炎模型和CRLM模型。苏木精-伊红（H&E）染色后发现,当40%的CCl4灌胃（6ml/kg小鼠体重,每周2次）5周后肝炎模型构建成功。灌胃7周,肝硬化模型构建成功。CRLM造模6天后小鼠即可出现CRLM（1/6）,而当建模12天后,超过80%（5/6）的小鼠肝脏出现了转移瘤。在肝炎的基础上构建CRLM模型。结果表明,炎症组肝转移率低于正常组（2/6 vs.5/6）,且活体成像总荧光强度、肝转移瘤最大直径和转移瘤个数等转移瘤负荷显著低于正常组（P值均小于0.05）。2、IFN-γ可能影响肝炎微环境中CRLM的发生过程ELISA法检测炎症小鼠血清及肝组织中IFN-γ,TNF-α和IL-1β的表达变化。结果发现,三者在炎症肝组织中表达无差异。而在炎症小鼠的血清中,表达均显著上调,尤其是IFN-γ,表达上调最为显著（倍数=6.55）。用shRNA-IRFGR1-CT26细胞在炎症模型基础上构建CRLM模型,IRFNG1敲低组肝转移率较高（8/10 vs.3/10）,转移瘤负荷也显著增高（P值均小于0.05）。3、肝脏炎症环境中let-7a簇与IRF-1表达呈负相关检索UCSC网站发现,let-7a簇转录起始位点上游存在多个IRF-1/2结合位点。qRT-PCR和Western blot检测发现,IFN-γ的刺激均能显著上调HT29和CT26.WT细胞IRF-1的表达,而IRF-2的表达无显著差异。IHC检测伴有肝炎的转移瘤肝组织进一步验证了上述结论。同时,研究还发现,IFN-γ刺激CRC细胞显著下调let-7a簇表达,但是,let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p表达下调无明显差异。4、IRF-1参与IFN-γ下调let-7a簇的表达Rescue实验结果显示,在HT29细胞中,干扰IRF-1的表达能显著削弱IFN-γ下调let-7a簇表达的趋势（P<0.01）。IFN-γ处理HT29,能同时显著下调let-7a-1-5p及其前体的表达水平（P<0.05）,但二者下调趋势无差异（P>0.05）。染色质免疫共沉淀实验（ChIP）结果显示,引物4（chr9:96,931,077-96,931,229）扩增效率显著增高,提示该位点可能存在IRF-1的结合位点。本研究将879bp目的基因（包含chr9:96,931,077-96,931,229）构入报告质粒（let-7a-Report-WT）中,并在718-721（AATC）处构建缺失突变（let-7a-Report-MT）。双荧光素酶报告基因实验发现,IRF-1能结合在位点（718-721）上。5、结直肠癌细胞的let-7a-1-5p表达水平与其肝转移能力相关用shRNA-let-7a-1-5p-CT26和LV-let-7a-1-5p-CT26细胞株建立转移瘤模型。结果显示,与对照组相比,let-7a-1-5p敲低组CRLM发生率降低（1/6 vs.4/6）,荧光强度强度较弱（P=0.05）,转移灶数目少（P<0.05）,转移瘤最大直径较小（P=0.05）。而let-7a-1-5p高表达组CRLM发生率稍高（6/6 vs.5/6）,转移瘤负荷显著增高（P<0.05）。此外,在肝炎小鼠中,let-7a-1-5p敲低同样降低CRLM发生（1/10 vs.5/10）,且肿瘤负荷均显著低于高表达组（均P<0.05）。6、抑制let-7a簇的表达维持CRC细胞的间质表型在构建shRNA-let-7a-1-5p-HT29细胞系的过程中,HT29的细胞形态由上皮细胞型态转变成间质样细胞型态。我们用qRT-PCR和Western blot检测EMT相关marker后发现,IFN-γ刺激HT29后,E-cadherin表达显著增加,而N-cadherin和Vimentin的表达未见显著差异。敲低HT29细胞let-7a-1-5p表达也得到了相同的结论。再用IHC检测肝转移瘤组织中的N-cadherin,结果发现,肝脏炎症组和let-7a-1-5p低表达组的转移瘤组织中N-cadherin阳性率显著增加。结论:1.CCl4诱导的肝脏炎症微环境能降低结直肠癌肝转移的发生,IFN-γ在调控中起重要作用;2.IRF-1通过结合let-7a簇转录本上游区域,介导IFN-γ下调let-7a簇的表达,降低CRC细胞肝转移潜能;3.在炎症微环境中let-7a-1-5p低表达能减少CRLM的发生;4.Let-7a簇通过上调结直肠癌细胞的N-cadherin表达,促进了上皮-间质转化,从而降低了肿瘤细胞在肝脏中的定值能力。