【摘 要】
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真核生物的组蛋白与DNA构成核小体,继而压缩形成染色质。但这种复杂构象确实会影响了DNA的复制,转录和修复等活动。促进染色质转录因子(Facilitate Chromatin Transcription,
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真核生物的组蛋白与DNA构成核小体,继而压缩形成染色质。但这种复杂构象确实会影响了DNA的复制,转录和修复等活动。促进染色质转录因子(Facilitate Chromatin Transcription,FACT)复合物是H2A-H2B的结合伴侣,由SPT16和POB3/SSRP1这2个亚基构成,能够影响基因的复制,转录和修复等活动。嗜热四膜虫具有特殊的核发育阶段,为了解组蛋白伴侣在染色质装配中如何发挥作用提供了可能。本文对FACT的亚基Pob3在四膜虫中的功能展开了详尽的研究。结果如下:1.嗜热四膜虫中POB3基因生物信息学分析促进染色质转录复合物FACT由SPT16和POB3/SSRP1这2个亚基构成,且POB3和SPT16这2个亚基存在协同进化。实时荧光定量PCR发现,POB3在整个结合生殖的表达量较高,并在6 h达到顶峰,不过,在营养生长以及饥饿时期表达水平很低。2.HA-Pob3定位在小核和大核为了研究Pob3在四膜虫细胞中的定位,构建了包含HA-Tag的质粒pXS75-POB3。免疫荧光定位表明,HA-Pob3在生长,饥饿和接合生殖时期都定位在小核和大核,其中凋亡的亲本大核和小核定位消失;但在接合生殖末期,只定位在小核。结果表明Pob3可能不仅参与了大核转录和小核复制的进行,也参与小核结构的维持。3.Pob3的N端结构域和C端结构域协同参与Pob3蛋白定位删除包含核定位信号序列NLS(24-33)的N端结构域后,HA-Pob3△33于结合生殖前期没有定位;核选择时期,其在凋亡的小核和大核没有定位,唯独定位在选择出来的配子核;在anlagen,定位在新大核,而小核没有定位。截短C端(350-437)结构域后,在整个结合生殖过程中,HA-Pob3△87仅定位于细胞质,表明Pob3在细胞中的定位直接受到了其C端酸性区域的影响。结果发现,Pob3的N端和C端结构域一同参与了其在细胞中的定位,而且可能拥有不一样的入核机制。4.POB3敲减抑制了四膜虫合子核和配子核的有丝分裂为了研究Pob3在四膜虫中的功能,构建了干扰质粒pPOB3hpNEO。结果表明,27%的配对细胞,在配子核有丝分裂结束后,随即异常分开,成为多小核单细胞;剩余细胞继续发育,其中75%的细胞合子核有丝第二次分裂无法进行。将结合生殖时期的细胞用溶酶体和自噬体荧光探针标记后,发现在anlagen阶段,亲本大核可以按照自噬途径进行程序化降解。结果表明,Pob3参加调控了合子核和配子核的复制和有丝分裂。本研究首次鉴定了嗜热四膜虫促进染色质转录复合物亚基Pob3。Pob3定位在各个发育阶段的小核和大核上,其中凋亡的亲本大核和小核定位消失。干扰POB3发现无法进行合子核的有丝第二次分裂。结果表明,Pob3不但能够参与大核的转录和小核的复制及结构维持,而且能够参与调控了合子核和配子核的有丝分裂和复制。
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