论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV2）、猪细小病毒1型（Porcine parvovirus type 1,PPV1）和伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）是三种最重要的猪病原体,并常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来出现的PRV变异株对伪狂犬病的临床防控提出新的挑战。因此,研制安全有效的防制这三种疫病的疫苗具有重要科学价值。Cap蛋白和VP2蛋白分别为PCV2和PPV1的主要免疫保护性抗原,是研制基因工程疫苗理想的靶蛋白。PRV作为活载体表达外源保护性抗原成为基因工程疫苗的研究热点。本研究旨在构建高水平表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒,为防制这三种病毒性疾病提供基因工程候选疫苗株。为了构建表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组病毒,选择非必需基因TK基因作为插入位点。以重组质粒pMD18T-LR（TK）-EGFP为骨架,首先将密码子优化的PPV1-VP2基因替换EGFP,构建重组质粒pMD18T-LR（TK）-VP2opti,同时将PRV-gG信号肽序列与密码子优化的PPV1-VP2基因偶联,构建了重组质粒pMD18T-LR（TK）-VP2opti（SP）。本试验采用经典的同源重组技术构建重组病毒,利用磷酸钙转染方法将重组病毒rPRV-TK-/gE-/gG-/3Cap+基因组与pMD18T-LR（TK）-EGFP共转染PK-15细胞,以EGFP作为标记经16轮正向蚀斑克隆筛选和PCR法鉴定,获得纯化重组病毒rPRV-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+;再将其基因组与重组质粒pMD18T-LR（TK）-VP2opti和pMD18T-LR（TK）-VP2opti（SP）分别共转染PK-15细胞,经6轮反向蚀斑克隆筛选和PCR鉴定,分别获得纯化的2株重组病毒rPRV-TK-/VP2+/gE-/gG-/2Cap+和pMD18T-LR（TK）-VP2opti（SP）。IPMA和IFA法分别对2株构建的重组病毒进行鉴定。IPMA结果表明这2株重组病毒均可表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白;IFA结果表明重组病毒rPRV-TK-/VP2+/gE-/gG-/2Cap+表达的PPV1-VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK-/VP2+（SP）/gE-/gG-/2Cap+表达的PPV1-VP2蛋白定位于细胞浆。病毒生长动力学试验结果显示,这2株重组病毒在PK-15细胞上具有较高的增殖滴度,但比亲本PRV-JF株略低。为了验证重组病毒rPRV-TK-/VP2+/gE-/gG-/2Cap+和rPRV-TK-/VP2+（SP）/gE-/gG-/2Cap+在动物体内的免疫原性,免疫接种68周龄健康雌性Balb/c小鼠进行免疫原性试验。通过临床症状观察,检测血清中PRV、PCV2和PPV1抗体水平,对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。免疫重组病毒活毒的小鼠未出现明显的临床症状,表明构建的重组病毒安全性较好。用微量中和试验法检测到重组病毒活毒和灭活重组病毒均能诱导小鼠产生PRV中和抗体,而IPMA法检测PCV2和PPV1抗体,结果显示灭活重组病毒免疫的小鼠检测到低水平的PCV2和PPV1抗体,重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体的产生。本研究成功构建了2株表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组病毒,体外试验证实了重组病毒表达的PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的抗原反应活性。重组病毒活毒和灭活重组病毒均能诱导小鼠产生PRV抗体,而仅灭活重组病毒诱导小鼠产生低水平的PCV2和PPV1抗体。重组PRV表达的PPV1-VP2和PCV2-Cap蛋白免疫原性不良的原因有待进一步探讨。