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研究背景:肝细胞肝癌是目前世界上最高发最常见的癌症之一。在我国,目前肝细胞肝癌的发病率位居第二位,仅次于第一位的肺癌。目前,肝细胞肝癌的治疗手段仍以手术切除肿瘤为主,生存率在五年之内依然较低。限制肝细胞肝癌外科手术治疗疗效的关键点在于早期因无症状而导致诊断率较低和外科术后再次复发概率较高,而外科手术以外却缺少效果明确的临床辅助治疗,因此深入开展对肝癌发生、增殖、侵袭中的肿瘤分子机制研究、开发新的治疗靶点以及新型的临床诊疗肿瘤标记物将成为当今肿瘤机制研究的热点问题。长链非编码RNA(LncRNA)与编码基因相比,缺少显著的开放性阅读框架,更少的外显子,更低的表达水平的非编码RNA,且核苷酸总数大于200个。很长一段时间以来,大部分有关基因的研究都把目光集中在蛋白编码基因上,人们都遵循着DNA-mRNA-蛋白质这一中心法则,而非编码基因曾经被研究者误定义为是基因组中的“暗物质”或者“噪音”。最近几年,大量实验证明,一些基因组中的“噪音”转录而来的长链非编码RNA在转录水平、表观遗传水平、蛋白修饰过程、翻译水平中都可以发挥非常重要的调节作用。反义LncRNA,顾名思义是一类从编码基因的反义链上转录进而剪切形成的LncRNA,它们在很多种癌症的发生、增殖、侵袭以及发展过程中同样起着非常重要的影响。细胞粘附分子1反义链RNA1(LncRNA CADM1-AS1),作为一种反义链的LncRNA,在肾透明细胞癌中首先被发现并且证实是低表达。然而,没有文章报道LncRNA CADM1-AS1是否可以影响肝癌的增殖和发展过程。研究目的:检测细胞粘附分子1反义RNA1(CADM1-AS1)在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达水平以及LncRNA CADM1-AS1与肝细胞癌患者临床信息、生理、病理指标的关系。其次,研究LncRNA CADM1-AS1与肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及细胞周期的关系。最后,进一步分析LncRNA CADM1-AS1在肝癌中起作用的可能分子机制,为以后研究肝癌发生以及发展机制提出新的观点。研究方法:1.lncRNA CADM1-AS1在肝癌中差异性表达1.1收集90例临床已经确诊为肝癌患者的肝癌组织以及对应的癌旁正常组织,采用ISH原位杂交技术检测肝癌患者LncRNA CADM1-AS1在肝癌组织及癌旁组织中的表达差异,同时收集患者个人信息和详细临床资料,然后统计数据用χ2检验分析LncRNA CADM1-AS1表达水平与临床肝细胞癌患者年龄、患者性别、患者血液中AFP含量、患者肝癌肿瘤分级和患者肝癌肿瘤TNM分期等指标的相互关系。采用K-M生存曲线统计方法分析LncRNA CADM1-AS1表达水平对肝癌患者生存期的影响。采用多因素COX回归方法分析哪些指标是肝癌患者的独立危险因素。1.2运用qRT-PCR方法,分析LncRNA CADM1-AS1在三种人肝癌细胞系(HepG2,BEL-7402,Huh-7)与人正常肝细胞系LO2细胞中的LncRNA CADM1-AS1表达情况。2.观察LncRNA CADM1-AS1在体内和体外对肝癌细胞生物行为学能力影响及相关分子机制研究2.1采用特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)化学片段转染细胞,下调肝癌细胞系细胞内LncRNA CADM1-AS1的表达,采用特异性的过表达慢病毒转染细胞,上调肝癌细胞系细胞内LncRNA CADM1-AS1的表达,分别建立低表达及过表达LncRNA CADM1-AS1肝癌细胞系。2.2采用CCK-8实验、EDU实验以及细胞克隆形成实验检测LncRNA CADM1-AS1对肝癌细胞增殖的影响;2.3采用Transwell小室实验以及细胞划痕实验检测LncRNA CADM1-AS1对肝癌细胞侵袭能力及迁移能力的影响;2.4采用流式细胞仪检测LncRNA CADM1-AS1对肝癌细胞周期的影响;2.5采用肝癌裸鼠皮下种瘤模型检测LncRNA CADM1-AS1对肝癌细胞的体内肿瘤形成以及增值能力的影响;2.6通过Western blotting实验及免疫组化实验检测体外及体内LncRNA CADM1-AS1对PTEN/AKT/GSK-3β信号通路及细胞周期蛋白(CDK2,CDK4,CDK6,CyclinD,CyclinE,P15,P21,P27)的表达影响;研究结果:1.LncRNA CADM1-AS1在肝癌中差异性表达1.1 ISH结果显示LncRNA CADM1-AS1表达水平与肝癌有着密切关系,肝癌中存在LncRNA CADM1-AS1明显下调的现象。进一步分析患者的LncRNA CADM1-AS1表达水平与临床数据(性别、年龄、AFP、肿瘤分级及TMN分级)的关系,发现LncRNA CADM1-AS1与肿瘤分级及TNM分期成负相关。1.2 qRT-PCR实验结果也显示在三种肝癌细胞系中LncRNA CADM1-AS1的表达水平明显低于正常肝细胞系。2.LncRNA CADM1-AS1对肝癌细胞系HepG2及BEL-7402增殖、迁移、侵袭以及细胞周期的影响以及相关分子机制的研究。2.1采用LV-CADM1-AS1和LV-control慢病毒感染HepG2和BEL-7402细胞,显著提高了肝癌细胞HepG2或BEL-7402的LncRNA CADM1-AS1表达水平,采用特异性si-CADM1-AS1-1和si-CADM1-AS1-2转染HepG2和BEL-7402细胞后,显著抑制了肝癌细胞HepG2或BEL-7402的LncRNA CADM1-AS1表达水平。2.2 CCK8和EDU结果显示LncRNA CADM1-AS1过表达后,HepG2和BEL-7402肝癌细胞的增殖能力明显减弱。LncRNA CADM1-AS1低表达后,HepG2和BEL-7402肝癌细胞的增殖能力明显增强。细胞克隆形成实验结果显示LncRNA CADM1-AS1过表达后,两种肝癌细胞(HepG2和BEL-7402)的克隆形成能力显著减弱;相反,干扰LncRNA CADM1-AS1表达后,两种肝癌细胞(HepG2和BEL-7402)的克隆形成能力显著增强。2.3 Transwell小室实验以及细胞划痕实验结果显示LncRNA CADM1-AS1过表达后,两种肝癌细胞(HepG2和BEL-7402)的迁移能力和侵袭能力显著减弱,LncRNA CADM1-AS1低表达后,两种肝癌细胞(HepG2和BEL-7402)的迁移能力和侵袭能力显著增强。2.4流式细胞仪分析各组细胞周期差异,结果显示LncRNA CADM1-AS1过表达后,两种肝癌细胞(HepG2和BEL-7402)出现显著的G0/G1期升高。干扰LncRNA CADM1-AS1表达后,肝癌细胞出现明显的G0/G1期降低。2.5肝癌裸鼠皮下种瘤结果显示LncRNA CADM1-AS1过表达后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度明显减缓,最终肿瘤体积以及肿瘤重量明显低于对照组,表明LncRNA CADM1-AS1能够明显抑制裸鼠体内HCC细胞的增殖能力。2.6 Western blotting实验结果显示AKT/GSK-3β通路中,与对照组相比,p-AKT(S473,T308),p-GSK-3β(S9)在过表达LncRNA CADM1-AS1组明显降低,在低表达LncRNA CADM1-AS1组明显升高。细胞周期蛋白中,与对照组相比,CDK2,CDK4,CDK6,cyclinD,cyclinE在过表达CADM1-AS1组明显降低,在低表达CADM1-AS1组明显升高。p15,p21,p27在过表达CADM1-AS1组明显升高,在低表达CADM1-AS1组明显降低。研究结论:1.本文揭示了LncRNA CADM1-AS1在肝癌组织中表现为低表达,且与患者的肝癌的肿瘤分级、TNM分期呈负相关,与肝癌患者的生存期呈正相关。可作为HCC患者的肿瘤分子标记物。2.LncRNA CADM1-AS1抑制HCC细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力和诱导细胞周期G0/G1期停滞,以及抑制HCC细胞的裸鼠体内增殖能力。3.LncRNA CADM1-AS1通过抑制AKT/GSK-3β通路,以及促进细胞周期蛋白p15-cyclinD/CDK4/CDK6,p21/p27-cyclinE/CDK2通路,进而抑制HCC细胞的增殖。