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一.研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致心血管疾病的重要原因之一。日益增多的证据表明,AS是一种对血管损伤的过度炎症反应。血管损伤后,单核细胞、血小板和淋巴细胞粘附到血管壁,释放一系列细胞因子和肽类生长因子,与特异性受体结合后转导影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)和血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts,AF)表型和生长的信号,因此促进了晚期纤维增殖病变的发生。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-a)是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白,它是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在AS的发生发展中起着关键作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。它是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一,作为一种与生长因子结合的共受体(co-receptor),调控着多种细胞的生物学效应,在细胞伸展、细胞识别、细胞粘附、细胞迁移和细胞增殖中扮演着重要的角色,同时也介导炎症反应。鱼腥草广泛分布于自然界,是中国药典收载的传统中药品种,有多年抗炎、抗菌、免疫调节等临床应用的经验和历史。鱼腥草素(houttnin)作为鱼腥草的主要成分之一,七十年代已完成了人工的化学合成,现代药理研究表明,鱼腥草素具有一定的抗炎、抗菌和免疫调节等作用,其药效团为β-醛酮结构。二.研究目的本课题以抗炎活性单体鱼腥草素经结构改造后获得的一种低毒高效的新型鱼腥草素衍生物(new houttnin derivative,NHD)为观察对象,通过建立体外细胞培养模型,了解NHD对TNF-α诱导的大鼠VSMCs及NIH/3T3细胞的增殖和syndecan-4蛋白表达的影响,争取获得其新的生物活性,为拓宽NHD的临床应用范围提供相关的实验依据。三.方法1.细胞增殖的检测:实验一:应用96孔板体外培养大鼠VSMCs,分别以终浓度为TNF-α20ng/mL、NHD 4μg/mL、NHD 8μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL作用24小时,每组浓度设12个复孔,同样实验条件重复2次,每组共24例数据,并设立对照组进行比较,对照组共24例数据,以明确应用NHD是否能抑制TNF-α引起的VSMCs增殖。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态。实验二:96孔板体外培养NIH/3T3细胞,分别以终浓度为TNF-α20ng/mL、NHD 4μg/mL、NHD 8μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL作用24小时,每组浓度设7个复孔,同样实验条件重复3次,每组共21例数据,并设立做为对照组进行比较,对照组共21例数据,以明确应用NHD是否能抑制TNF-α引起的NIH/3T3细胞增殖。采用MTS/PMS法确定NIH/3T3细胞的增殖状态。2.Syndecan-4蛋白表达的检测:实验一:体外培养大鼠VSMCs,分别以终浓度为TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD 8μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL作用24小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定大鼠VSMCs syndecan-4蛋白的表达情况。重复实验3次。实验二:体外培养NIH/3T3细胞,分别以终浓度为TNF-α20ng/mL、NHD4μg/mL、NHD 8μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL、TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL作用24小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白的表达情况。重复实验3次。四.结果1.NHD对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响在药物分别或共同作用24小时的条件下,各组细胞增殖率分别为:对照组1.262±0.105,TNF-α20ng/mL组1.505±0.137,NHD 4μg/mL组1.282±0.110,NHD8μg/mL组1.217±0.108,TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组1.325±0.122,TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组1.228±0.111。统计分析显示,与对照组比较,TNF-α20ng/mL组能刺激大鼠VSMCs的增殖(t=-6.894,P＜0.001),TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P＜0.001),TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P＜0.001)。2.NHD对TNF-α诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响以对照组目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值为1,各组syndecan-4蛋白表达结果分别为:TNF-α20ng/mL组1.321±0.052,NHD 4μg/mL组1.004±0.111,NHD 8μg/mL组0.902±0.667,TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组1.029±0.070,WNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组0.991±0.046。统计分析显示,与对照组比较,TNF-α20ng/mL组能刺激大鼠VSMCs syndecan-4蛋白的表达(t=-10.766,P=0.009),TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P=0.001),TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P＜0.001)。3.NHD对TNF-α诱导的NIH/3T3细胞增殖的影响在药物分别或共同作用24小时的条件下,各组细胞的增殖率分别为:对照组0.577±0.052,TNF-α20ng/mL组0.621±0.041,NHD 4μg/mL组0.514±0.149,NHD8μg/mL组0.490±0.155,TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组0.52±0.112,TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组0.420±0.149。统计分析显示,与对照组比较,TNF-α20ng/mL组能刺激NIH/3T3细胞的增殖(t=-3.098,P=0.004),TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P=0.003),TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较有抑制细胞增殖的作用(P＜0.001)。4.NHD对TNF-α诱导的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响以对照组目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值为1,各组syndecan-4蛋白表达结果分别为TNF-α20ng/mL组1.305±0.042,NHD 4μg/mL组0.988±0.038,NHD 8μg/mL组0.963±0.021,TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组1.0134±0.027,TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组0.990±0.016。统计分析显示,与对照组比较,TNF-α20ng/mL组能刺激NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白的表达(t=-12.706,P＜0.001),TNF-α20ng/mL联用NHD 4μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P＜0.001),TNF-α20ng/mL联用NHD 8μg/mL组与TNF-α20ng/mL组比较能抑制syndecan-4蛋白的表达(P＜0.001)。五.结论本研究证明了一定剂量的NHD能够抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs及NIH/3T3细胞的增殖和细胞中syndecan-4蛋白的表达。因此,有必要将NHD作为一种药物先导物,进一步研究其相关潜在治疗作用。