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硒是人体必须的微量元素之一,适量的硒可以起到预防和控制癌症、心血管疾病、白内障、大骨节病、延缓衰老、提高免疫力等一系列重要作用。人体内过度缺硒可导致许多疾病的发生。硒蛋白(Selenoprotein)是近年来发现的一类通过特殊编码机制编码的蛋白质。在动物及部分细菌中硒以硒代半胱酸(Selenocystine,Sec)的形式,利用三个终止密码之一的UGA作为密码子,通过一套高度特化的编码和合成机制编码到蛋白质当中,因此硒代半胱氨酸被认为是生物体内的第二十一种氨基酸。硒的很多生理功能都与硒蛋白的功能密切相关,已经搞清功能的硒蛋白都是重要的酶类,硒元素都位于这些蛋白酶的活性中心上。
目前,在人体中已经发现了25种硒蛋白,尽管在硒蛋白基因的分子功能方面,谷胱苷肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)、脱碘酶(iodothyronine deiodinases)、硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductases)、硒蛋白P(SelenoproteinP)和Sepl5、SelS等基因的分子功能已经得到一定研究,但是仍有很多硒蛋白基因的分子功能属于未知,SelK即是其中功能未知的蛋白质之一。
以人体为材料进行人体硒蛋白生理功能的相关研究存在诸多的困难与不便,而果蝇硒蛋白G-rich是人硒蛋白SelK的基因同源物,且果蝇是遗传学研究的重要模式生物之一,为此以果蝇为试材,以硒蛋白G-rich为研究对象开展基因的分子功能研究是硒蛋白生理功能研究的重要方式之一,所取得的成果将为人硒蛋白SelK的研究打下坚实基础。
果蝇硒蛋白G-rich是果蝇体内所含的三种硒蛋白之一,也是果蝇当中唯一基因功能未知的硒蛋白。G-rich是12kDa的富含甘氨酸(Glycine)的蛋白质,对于果蝇硒蛋白G-rich了解很少,只知道G-rich为X染色编码的,有一次跨膜序列的膜蛋白,定位于高尔基体,此蛋白的功能未知。
本研究以果蝇硒蛋白G-rich为研究对象,通过整体原位杂交、RT-PCR检测及G-rich基因敲低后成活率统计等来研究果蝇硒蛋白G-rich对果蝇个体发育的影响,通过G-rich dsRNAi果蝇S2细胞基因芯片及Real Time PCR检测果蝇G-rich相关基因群,通过G-rich敲低和过表达研究其对果蝇S2细胞钙稳态的影响,以此揭示果蝇硒蛋白G-rich的分子功能,并将果蝇硒蛋白G-rich转染人胃癌BGC-823细胞,进一步证实果蝇硒蛋白G-rich的功能,为进一步阐明人体硒蛋白SelK的生理功能打下坚实基础。
方法：
1、以黑腹果蝇不同发育时期的胚胎为对象,用地高新标记的果蝇硒蛋白G-rich反义RNA为探针与果蝇卵进行整体原位杂交,对果蝇硒蛋白G-rich mRNA在胚胎发育不同时期的表达部位进行检测。
2、分别提取黑腹果蝇卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹和成虫总RNA,进行RT-PCR扩增,通过半定量RT-PCR,检测果蝇硒蛋白G-rich在个体发育不同时期表达量的变化。
3、用PCR的方法,获得两端带有T7启动子的G-rich模板序列,经转录、复性获得dsRNA,通过显微注射果蝇胚胎的方法,将dsRNA导入果蝇胚胎内,诱导RNAi效应,观察G-rich的基因敲低对果蝇胚胎发育的影响,并通过观察GAL4转基因系和UAS靶基因系杂交后代性状变化,以检测G-rich基因敲低对果蝇个体发育的影响。
4、体外合成G-rich dsRNA,采用浸泡的方法,将dsRNA导入果蝇S2细胞,获得基因敲低后的mRNA,通过基因芯片检测探讨G-rich基因敲低对其它基因表达的影响,以检测果蝇硒蛋白G-rich的相关基因群,并对部分基因进行Real TimePCR验证。
5、分别通过dsRNA孵育果蝇S2细胞和pAc-G-rich-DsRed(红色荧光)质粒转染果蝇S2细胞,利用钙离子荧光染料Fluo-3AM(绿色荧光)检测G-rich基因敲低前后和过表达前后细胞内钙离子浓度变化。
6、Pac-G-rich-GFP表达质粒转染果蝇S2细胞;构建pEGFP-G-rich(绿色荧光)质粒,转染人胃癌BGC-823细胞。通过GFP活体荧光显色与内质网(Endoplasmic reticulurn,ER)、高尔基体(Golgi apparatus)荧光染色,应用激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Comfocal Microscope,LSCM)检测G-rich蛋白在细胞中的定位。
7、构建pEG-rich-DsRed(红色荧光)质粒,转染人胃癌BGC-823细胞,利用钙离子荧光染料Fluo-3AM检测G-rich在胃癌细胞过表达后胞内钙离子浓度变化,应用LSCM、电子显微镜(Electron microscopy,EM)检测凋亡,进一步证实果蝇硒蛋白G-rich的生物功能。
结果：
1、对果蝇胚胎进行整体原位杂交结果表明,果蝇硒蛋白G-rich在果蝇胚胎的中胚层和中肠中有大量表达。
2、对黑腹果蝇卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹和成虫进行RT-PCR检测结果显示,果蝇硒蛋白G-rich在果蝇个体发育的各个阶段都有表达,其中在三龄幼虫时期表达量明显增高。
3、通过dsRNA显微注射果蝇胚胎诱导瞬时RNAi效应的结果发现,G-rich基因敲低后,果蝇从卵发育到蛹的成活率低于对照组,并且发育迟缓。转基因果蝇杂交获得持续G-rich敲低的果蝇发育结果显示,随着G-rich基因敲低效果增强,从三龄幼虫到成虫成活率也降低,并且耐高温生存能力降低。G-rich基因敲低的杂交果蝇与亲本相比抵抗H2O2氧化压力的能力降低。
4、果蝇S2细胞硒蛋白G-rich基因敲低后基因芯片检测结果发现,位于内质网上的与胞内钙稳态相关的基因Inositol1,4,5,-tris-phosphate receptor(IP3R)的表达水平显著降低,Inositoll,4,5,-tris-phosphate Kinase(IP3K)的表达量显著升高,并且Real Time PCR检证结果与基因芯片检测结果一致。抗氧化酶,蛋白水解酶,与抗菌、细胞编程性死亡、自体吞噬的细胞死亡相关的蛋白等多数基因的表达也有大幅上调趋势。
5、钙离子荧光显色表明,经G-rich dsRNAi的果蝇S2细胞胞内钙离子浓度显著下降,转染含G-rich质粒获G-rich过表达的果蝇S2细胞中胞内钙离子浓度显著升高。
6、果蝇硒蛋白G-rich进行细胞定位研究表明果蝇硒蛋白G-rich不仅位于细胞高尔基体上,在内质网上也有表达。
7、携带果蝇硒蛋白G-rich的质粒转染人胃癌BGC-823细胞后,细胞中的钙离子浓度明显提高,进一步证明了G-rich对内质网中钙离子释放的促进作用。且癌细胞出现异染色质凝集边集、核型不规则、线粒体脊减少,粗面内质网水肿及出现凋亡小体等细胞凋亡的典型特征。
结论：
1、果蝇硒蛋白G-rich在果蝇个体发育的各个阶段都有表达,其中在三龄幼虫时期表达水平为最高,在胚胎发育阶段主要位于中肠,中胚层中,可能与肌肉、骨骼的发育和循环系统、消化系统的形成有关。
2、G-rich在果蝇胚胎发育过程中具有重要作用,G-rich表达量的下调,影响果蝇的发育,降低耐热生存能力,甚至导致致死表型。
3、G-rich具有部分抗氧化功能,敲低后降低果蝇抵抗氧化能力。
4、果蝇硒蛋白G-rich不仅位于细胞中的高尔基体上,而且位于内质网上。
5、果蝇硒蛋白G-rich影响IP3R和IP3K的表达,引起细胞内钙离子浓度变化。
6、果蝇硒蛋白G-rich在人胃癌BGC-823细胞中过表达时不仅引起胞内钙离子浓度升高,而且会诱导癌细胞凋亡。