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在肿瘤的形成过程中包含两大类机制,基因机制（genetic mechanism）和表观基因机制（epigenetic mechanism）。基因机制包括基因突变、染色体丢失和重排,产生结构异常的基因产物;表观基因机制主要指甲基基团与基因组中CpG二核苷酸的胞嘧啶环第5碳原子以共价键的形式结合,形成5-甲基胞嘧啶,引起基因表达异常而DNA序列及基因产物不变。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化发生并维持的。随着人类基因组计划的完成,DNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用日趋受到重视,DNA甲基转移酶的作用也引起越来越多学者的注意。研究背景膀胱移行细胞癌是我国最常见的尿路上皮肿瘤,目前对膀胱癌的诊断主要是依赖有创的膀胱镜检和病理活检。通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否有肿瘤,明确肿瘤的数目、大小、形态及部位。并且可以对肿瘤或可疑病变部位进行活检以明确诊断。膀胱肿瘤通常为多灶性。原位癌可以类似炎症、发育不良等病变,表现为浅红色天鹅绒样粘膜改变,也可以表现为正常。于单一的乳头状瘤,如果其他部位的膀胱粘膜表现为正常切尿脱落细胞学阴性,不主张常规行随机活检,因为发现原位癌的可能性很低。易复发是它的一大特点,在行保留膀胱的肿瘤切除术后,即使定期辅以膀胱腔内灌注化疗,仍有10%～40%复发率,部分还出现分级、分期进展或者发生转移。术后较高复发率因素:（1）膀胱肿瘤病理类型是影响局部复发的主要因素,特别是盆腔复发的危险性与肿瘤的病理类型直接相关;（2）膀胱肿瘤局部复发与原发肿瘤的分期、分级也密切相关,并按顺序依次递增;（3）膀胱肿瘤术后局部复发与原病变部位和切除范围有关,位于项部、前壁及侧壁肿瘤显露好,手术切除率高,局部复发率低。三角区、底部、输尿管开口处因病变部位低术野窄而深,显露困难操作受限致切除范围不深,而引起切缘癌组织残留导致癌术后复发;（4）术后不能正规的膀胱灌注及定期随访。因此,寻找一种特异性、敏感性较高,能预判膀胱移行细胞癌生物学行为的肿瘤标志物,从而指导临床治疗方案的选择尤其重要。研究表明肿瘤不仅是基因突变、缺失等引起的遗传性疾病,也是DNA甲基化作用引起的转录沉默等表遗传性疾病,DNA甲基化是在不改变基因DNA一级结构的情况下,改变其表达活性的基因外调节途径。许多研究表明,DNMT1的表达水平在多种肿瘤中增高,并与抑癌基因启动子高甲基化状态相关,启动子CpG岛高甲基化是抑癌基因表达沉默的重要机制之一,与肿瘤发生、发展密切相关。人类基因组中甲基化的CpG岛是通过一定数量的DNMT来维持的,其中DNMT1是主要的维持甲基化酶,DNMT1表达增加是引起CpG岛高甲基化的原因之一,因此,DNMT1在多种肿瘤细胞中呈高表达,是肿瘤细胞的特征性变化之一。随着人类表观基因组计划的提出和实施,DNA甲基化在肿瘤中的作用日趋受到重视,DNMT1的作用也引起越来越多学者的注意。研究目的许多研究表明,DNMT在多种肿瘤中的表达明显上调,其发生往往先于甲基化模式异常,因而是肿瘤细胞的一个具有特征的早期分子改变。DNMT活性增加可以促进甲基化的胞嘧啶脱氨基,引起胞嘧啶转变为胸腺嘧啶的速度增加,促进DNA的点突变发生;并可以促进肿瘤抑制基因发生高甲基化引起其表达沉默,使之丧失抑制肿瘤的生物学效应,因此,DNMT活性增加可以通过DNA高甲基化和促使突变的不同机制参与肿瘤的发生发展。Peng等运用免疫组化方法检测手术切除的48例正常胰管周围上皮组织、54例伴有炎症的胰管周围上皮组织、188例胰腺上皮内瘤样变组织和200例胰腺导管癌组织中的DNMT1蛋白的表达情况。结果显示DNMT1蛋白的表达水平在正常胰管周围上皮组织中最低,在癌变组织中表达较高。在低分化的肿瘤组织中其表达水平高于高分化肿瘤组织。提示DNMT1的异常表达参与胰腺癌的癌变过程。Tian等的研究发现唾液腺腺样囊性癌中存在DNMT1过表达,其阳性表达量随肿瘤抑制基因的甲基化量增高而增高。对肺癌DNMT1蛋白表达的研究结果显示,肺癌中DNMT1蛋白不仅高表达,且与肿瘤细胞的低分化趋向有关。Mizuno等检测HL-60、KU812、K562三种白血病细胞系DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA水平,发现3种DNMT的mRNA水平均较正常造血细胞升高,提示DNMT高表达可能与细胞向白血病转化有关。Robertson等用RT-PCR法检测3种实体肿瘤组织（结肠癌、肾癌、胰腺癌）中DNMT1的表达量,发现208肿瘤组织中DNMT1的mRNA水平较正常对照增高约4倍,因此,DNMT1在多种肿瘤细胞中呈高表达,是肿瘤细胞的特征性变化之一。膀胱移行细胞癌是我国最常见的尿路上皮肿瘤,目前对TCCB的诊断主要是依赖有创的膀胱镜检和病理活检。易复发是它的一大特点,在行保留膀胱的肿瘤切除术后,即使定期辅以膀胱腔内灌注化疗,仍有10%～40%复发率,部分还出现分级、分期进展或者发生转移。目前对膀胱移行细胞癌DNMT1蛋白的表达情况仍知之甚少,更缺乏其与肿瘤生物学行为和临床参数关系的研究。我们实验研究的目的在于研究DNA甲基转移酶1在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系。研究方法1.采用免疫组化SP法手术获取人膀胱移行上皮癌组织、癌旁组织以及膀胱镜检查时获取的正常膀胱组织,甲醛固定,石蜡包埋,3μm连续切片。切片脱腊、水化后,切片浸入0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）,微波煮沸3×5min进行抗原修复,冷却后0.1 mol/L PBS漂洗,然后用3%甲醇-H2O2灭活内源性过氧化物酶,0.1mol/L PBS漂洗,羊血清封闭后不洗,滴加1:100稀释的一抗,4℃孵育过夜;生物素标记的羊抗兔二抗孵育30min（室温）,加链霉亲和素-过氧化物酶室温下染色30min;DAB显色,苏木素复染,1%盐酸2乙醇分化20s,脱水、二甲苯透明后封片。2.DNA甲基转移酶1在各组中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系的研究。所有的免疫染色切片分别由两位观察者在显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。细胞质中有棕黄色颗粒物质为阳性染色细胞,20个高倍视野内阳性细胞比例的均值≥25%为DNMT表达阳性。观测DNMT1蛋白在癌区、癌旁和正常黏膜组织中阳性表达率的比较。观测DNMT1蛋白在60例膀胱癌患者中分别就年龄分组、性别分组、肿瘤分级分组及临床分期分组的阳性表达率情况的比较。对DNA甲基转移酶1在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系进行评估。统计方法:应用SPSS13.0统计软件包对DNMT1蛋白在60例膀胱癌患者中分别就年龄分组、性别分组、肿瘤分级分组及临床分期分组的阳性表达率数据进行分析处理,采用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.DNMT1蛋白在癌区、癌旁和正常黏膜组织中表达的比较60例膀胱移行细胞癌黏膜组织中,阳性率为86.7%,显著高于相应癌旁（43.3%）和正常黏膜组织（33.3%）。与空白对照组相比,阳性切片中可见DNMT1蛋白表达弥散分布于肿瘤的细胞质,染色较均匀。由以上结果可见DNMT1蛋白在移行细胞癌中高表达,DNMT1蛋白的异常表达参与膀胱移行细胞癌的癌变过程。2.膀胱移行细胞癌黏膜组织DNMT1蛋白表达与肿瘤患者各临床参数的相关性分析60例膀胱移行细胞癌黏膜组织中,高级别膀胱癌组织中DNMT1的阳性表达率要高于低级别者,男性患者膀胱癌组织中DNMT1的阳性表达率要高于女性患者（P＜0.01）。而≤60岁者DNMT1蛋白的表达阳性率与＞60岁者无显著差异,浅表性与浸润性膀胱癌组织中的DNMT1表达无明显差异（P＞0.05）。提示DNMT1蛋白表达与膀胱移行细胞癌年龄和临床分期无明显相关性,与肿瘤分化程度、性别呈一定的相关性。研究结论1.膀胱移行细胞癌组织中DNMT1的表达阳性率明显高于癌旁组织及正常膀胱粘膜组织,表明DNMT1在膀胱移行细胞癌组织中存在过表达,对于膀胱移行细胞癌的发生与发展有重要作用2.DNMT1在膀胱移行细胞癌的发生和发展中可能起到促进作用,并且和肿瘤细胞的分化程度有密切关系。与膀胱移行细胞癌年龄和临床分期无明显相关性。