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辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一种毁灭性的致病卵菌。由于目前对卵菌药靶的研究缺乏,阻碍了高效、环境友好新型抑菌剂的开发。本实验室前期筛选到的植物源化合物肉桂醛,在田间可高效防治辣椒疫病,但具体作用机制尚不明确。为了为新型、高效卵菌抑菌剂的研发提供新的理论支撑,本文初步探讨了肉桂醛对P. capsici的抑制机制,监测了肉桂醛诱导下P. capsici孢子内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)及游离Ca2+水平的动态响应,并简要阐明了Ca2+外排系统在肉桂醛抑制P. capsici过程中的重要性。1.肉桂醛介导P. capsici体内ROS积累及Ca2+外流。ROS作为细胞体内重要的信号分子,参与了生物体内许多的代谢过程。通过对P. capsici体内ROS的检测,发现肉桂醛处理一段时间后P. capsici体内ROS含量明显上升。外源添加ROS清除剂半胱氨酸(Cys)能够明显缓解肉桂醛对P. capsici的抑制作用。RT-PCR也显示NADPH氧化酶基因(nox1)的表达量上调,这说明ROS应激参与了肉桂醛对P. capsici的抑制过程。由于ROS与Ca2+之间有密切的相关性,因此检测了肉桂醛处理下P. capsici体内Ca2+含量,结果发现肉桂醛处理能够导致P. capsici孢子内Ca2+瞬间减少。而通过电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法检测P. capsici孢子外Ca2+含量,发现细胞外Ca2+含量明显上升,说明了Ca2+发生了外流。为进一步验证Ca2+信号的综合响应,我们使用各种不同的细胞内Ca2+通道抑制剂,发现肉桂醛处理下P. capsici孢子内Ca2+不仅发生了外流还有内流,但内流的程度远远小于外流的程度。用Ca2+螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)螯合P. capsici孢子内游离Ca2+, P. capsici生长明显受到暂时抑制。使用肉桂醛类似物苯丙醛处理P. capsici孢子,发现并没有抑制P. capsici的生长,这表明了肉桂醛α,β-不饱和双键的重要性。有文献报道瞬时受体电位离子通道(Transient receptor potential ion channel, TRP)通道蛋白的含巯基亲核半胱氨酸能够与肉桂醛α,β-不饱和双键发生加成反应从而引发Ca2+内流。外源添加加成反应的拮抗剂Cys能够明显缓解肉桂醛对P. capsici的抑制作用。综上推测：肉桂醛对P. capsici的勺抑制作用可能是通过加成反应导致Ca2+外排进而引发ROS应激,从而达到抑制效果。2.肉桂醛靶向性Ca2+泵和Ca2+交换蛋白的生物信息学方法筛选。目前在哺乳类动物细胞质膜上已被揭示的Ca2+外排系统有两类,一类是Na+/Ca2+或Na+/Ca2+-K+交换蛋白,一类是Ca2+泵(Ca2+-ATPase)。哺乳类动物中不同物种之间的Ca2+泵和Ca2+交换蛋白具有高度保守性,并且哺乳类动物与真菌中的Ca2+泵和Ca2+交换蛋白也具有一定的同源性。因此,我们下载人类和酿酒酵母中已知的所有Ca2+泵和Ca2+交换蛋白,在P. capsici基因组数据库中进行Blastp同源检索、Bioedit7.0司源比对,初步筛选到了48条Ca2+泵和5条Ca2+交换候选蛋白。基于Ca2+泵和Ca2+交换蛋白的结构保守性、生物学功能和蛋白序列同源性,将筛选得到的所有的P. capsici内Ca2+泵和Ca2+交换候选蛋白进行了跨膜结构域和保守功能结构域预测及系统发育分析,结果发现P. capsici内蛋白序列号分别为530934、566110、109926和535374、131120的Ca2+泵及Ca2+交换候选蛋白不仅具有10个左右的a螺旋跨膜结构域、Ca2+外排的功能,还与人类和酵母中的Ca2+泵和Ca2+交换蛋白亲缘关系非常近。因此,推测这五条蛋白可能是P. capsici内的Ca2+泵和Ca2+交换蛋白,但肉桂醛靶向性的Ca2+泵和Ca2+交换蛋白的最终确定还需通过进一步的体外真核表达和基因沉默实验来验证。本文探讨了肉桂醛对P. capsici的抑制机理,在研究中还存在很多尚未解决的问题,比如ROS是如何参与了肉桂醛对P. capsic的抑制过程,需要通过构建nox1基因沉默子来进一步的确认；Ca2+信号的变化是如何引发下游ROS的爆发,这也还需要进行后续的实验验证。