论文部分内容阅读
背景: 胃癌在全球发病率较高，是严重危害人类健康的恶性肿瘤。晚期胃癌患者约一半以上出现腹膜转移，临床治疗效果差。microRNA是由20多个核苷酸组成的非编码小RNA分子，与靶mRNA的3端非编码区结合，降解或抑制靶mRNA的翻译，导致靶mRNA功能沉默。有研究显示胃癌的miR-27a(microRNA-27a，微小RNA27a)表达上调，并证实其通过显著下调E-cadherin(E-钙粘蛋白)表达促使肿瘤侵袭转移。E-cadherin基因启动子区域甲基化是E-cadherin表达失活常见的原因。有文献证实胃癌腹膜转移组织E-cadherin表达量比胃癌组织更低。miR-27a很有可能在胃癌腹膜转移表达量要高于胃癌，导致了E-cadherin表达量比胃癌更低。本研究首次在胃癌腹膜高转移细胞系GC9811-P中研究miR-27a高表达情况以及miR-27a和E-cadherin基因表达的关系，并探讨miR-27a作为胃癌腹膜转移反义治疗靶点的可能性，对以后相关研究提供实验依据。 目的: 1、从人胃腺癌细胞SGC7901、人胃低分化腺癌细胞MKN-28、胃癌腹膜高转移性细胞GC9811-P等三种胃癌细胞中筛选出miR-27a过表达的细胞株。 2、探讨miR-27a和E-cadherin、E-cadherin基因启动子区域甲基化在胃癌腹膜高转移性细胞株GC9811-P中表达关联性;抑制GC9811-P的miR-27a表达后能否影响GC9811-P细胞增殖凋亡能力。 方法: 1、采用RT-PCR、WesternBlot、MSP、实时定量PCR技术分别检测SGC7901、MKN-28、GC9811-P的E-cadherin mRNA和蛋白、E-cadherin基因启动子区域甲基化、miR-27a的表达;比较它们在三种胃癌细胞系中表达的差异。 2、实验分组:空白对照组（只加入培养基）、阴性对照组(转染100nmol/LmiRNA-angagomir negative control-FAM)、转染组:(转染100nmol/L miR27a-antagomir-FAM); 3、运用antagomir瞬时转染GC9811-P细胞，24h后荧光显微镜观察转染效率;各实验组均采用RT-PCR、WesternBlot、MSP、实时定量PCR技术分别检测E-cadherin mRNA和蛋白、E-cadherin基因启动子区域甲基化、miR-27a的表达量，比较各组间它们的表达差异。 4、利用MTT法评价各处理组GC9811-P细胞的增殖情况;通过流式细胞仪观察各处理组GC9811-P细胞凋亡情况。 结果: 1、在三种胃癌细胞中，实时定量PCR结果显示GC9811-P细胞的miR-27a表达量最高(P＜0.05); RT-PCR和WesternBlot结果显示GC9811-P细胞的E-cadherin mRNA和蛋白表达水平最低(P＜0.05); MSP结果显示GC9811-P细胞的E-cadherin启动子区域甲基化表达水平最高(P＜0.05）。 2、antagomir瞬时转染胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P的转染效率可达到60％。转染组和空白对照组及阴性对照组比较，miR-27a表达明显降低(P＜0.05），E-cadherin mRNA和蛋白表达显著上调(P＜0.05），E-cadherin启动子区域基因高甲基化得到逆转(P＜0.05）。 3、MTT法检测到转染组的GC9811-P细胞增殖速度，明显低于空白对照组、阴性对照组(P＜0.05);转染组的CPIR（细胞增殖抑制率）明显大于阴性对照组(P＜0.05)，且在转染36h后最大。 4、流式细胞仪结果显示转染组的GC9811-P细胞系凋亡细胞率明显高于其它两组(P＜0.05)。 结论: 1、三种胃癌细胞中胃癌腹膜高转移性细胞株GC9811-P的miR-27a表达最高，E-cadherin表达量最低，E-cadherin基因启动子区域甲基化状态最明显; 2、下调胃癌GC9811-P细胞的miR-27a表达，能逆转E-cadherin基因启动子区域高甲基化，恢复E-cadherin表达;miR-27a能调控E-cadherin基因启动子区域甲基化过程导致E-cadherin表达下调。 3、下调胃癌GC9811-P细胞的miR-27a表达，其增殖能力减弱，促其凋亡;miR-27a可能作为胃癌腹膜转移反义治疗靶点。