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胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum,以下简称Pcc)是引起彩色马蹄莲细菌性软腐病的重要病原菌,并且寄主广泛,危害严重。实验室前期用Pcc与黄花马蹄莲(Zantedeschia elliotiana)组织离体互作,应用双向电泳技术(2-DE)和质谱技术,进行差异表达蛋白分析发现有70个蛋白点与未互作的野生型存在表达差异,其中包括ClpP蛋白、HSP33蛋白、天冬氨酸转氨酶(aspartate ammonia-lyase)和3-磷酸甘油转运相关蛋白(glycerol-3-phosphate transporter periplasmic binding protein),相应的编码基因为clpP, hsl, aspA, ugpB。为了阐明clpP, hsl, aspA, ugpB对Pcc在致病性等方面的影响。在本研究中,我们克隆了clpP, hsl, aspA, ugpB基因,用同源重组的方法构建相应基因的缺失突变株,明确了这四个基因对Pcc在运动性,致病性和生长能力等方面的影响,以此来推知基因的功能,为深入认识clpP, hsl, aspA, ugpB对Pcc的调控提供了科学依据。(一)采用PCR的方法从Pcc基因组中克隆到clpP基因,用同源重组法构建定向缺失突变体△clpP, PCR和Southern杂交结果显示,clpP基因被成功敲除。测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病相关胞外酶活、生物膜形成、生长能力、定殖能力及致病性等表型。研究后发现：(1)与野生型相比,△clpP的游动能力不变；(2)生物膜形成能力降低；(3)蛋白酶,纤维素酶和果胶酶酶活均有不同程度的降低,并用qRT-PCR从转录水平进行验证；(4)应激能力下降,与野生型相比,△clpP的耐高温和营养饥渴能力、抗氧化压力均下降；(5)△clpP定殖能力明显低于野生型菌株；(6)接种寄主叶片,致病性几乎丧失。基因互补可使上述表型恢复。试验表明：clpP基因是Pcc致病所必需的,其突变可使细菌丧失致病性。(二)采用PCR的方法从Pcc基因组中克隆到hsl, aspA, ugpB基因,用同源重组法构建定向缺失突变体△hsl,△aspA,△ugpB, PCR结果显示,hsl, asp A, ugpB基因被成功敲除,并构建了相应基因的过表达菌株。测定突变体运动性、致病相关胞外酶活、生物膜形成、生长能力、及致病性等表型。研究后发现：△hsl,△aspA,△ugpB的各个表型均与野生型无明显差别,接种寄主叶片后,致病性也未丧失或降低。试验表明：hsl, asp A, ugpB基因与Pcc致病不相关。