论文部分内容阅读
慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia, CML）是一种起源于骨髓内异常多能干细胞的骨髓增殖性疾病。临床上分慢性期、加速期和急变期。慢性期主要表现为成熟粒细胞增生，慢性期中位生存期3-5年，一旦进入加速期，原始细胞比例不断增高，最后进入急变期。患者病情进一步恶化，骨髓和外周血中未成熟细胞大量积累，呈现类似于急性白血病的表型，急变期中位生存期3-6个月。根据白血病发病机制的多次打击学说，一般需要两个突变或基因重排的遗传学异常事件共同作用才能导致急性髓系白血病的发生。其中一个分子事件大多累及酪氨酸激酶基因，赋予细胞生长增殖优势;另外一个分子事件累及造血调控相关因子，使得造血细胞分化阻滞、凋亡受抑。CML急变机制的研究一直是白血病科研领域研究的热点之一，因此在分子遗传学水平继续深入研究CML急变相关基因突变对阐述其急变发病机制及靶向治疗具有重要意义。 在前期工作中，我们随机收取85例急变或加速期慢性粒细胞白血病患者，并通过PCR结合DNA测序等技术手段对11个造血转录因子及两个信号转导分子的蛋白编码区和启动子区域进行了突变筛查，发现9.4％的患者出现了特异性的GA TA2点突变，此突变位于5号外显子，将蛋白C端锌指结构域359位亮氨酸突变为缬氨酸(L359V)，这些患者的慢性期标本未检测到该突变的发生。前期研究显示此突变能增强GATA2的转录活性，并能通过增强与PU.1的结合能力而负性调控PU.1对下游基因的转录激活作用;GATA2 L359V导入HL-60细胞能阻止其诱导分化。这些结果提示此突变对造血调控可能有着重要影响。 为了明确Gata2 L359V突变体在体内的功能，我们通过基因敲入技术建立了Gata2 L359V knock-in小鼠模型。通过我们的研究发现Gata2L359V knock-in小鼠纯合子胚胎于E11-E11.5发生早期死亡。E10.5纯合子胚胎发生发育阻滞，纯合子卵黄囊造血发育异常，血红蛋白表达水平严重降低，原始红细胞发育阻滞在红系祖细胞阶段。定量PCR结果显示Gata2L359V能显著上调Gata2本身的表达水平，同时抑制Gata1及红系下游转录因子Eklf和Klf2等的表达。我们推测Gata2 L359V突变体可能影响原始红系分化过程中“GATA Switch”的顺利进行，从而导致原始红系分化成熟受阻，胚胎致死。 虽然Gata2 L359V knock-in杂合子成体小鼠在正常环境下与野生型小鼠相比未见显著异常，但经过5-FU处理后，Gata2 L359V杂合子成体小鼠造血恢复能力异常减弱;造血干细胞Brdu掺入实验结果显示，杂合子小鼠造血干细胞增殖能力显著增强;骨髓竞争性移植实验进而揭示杂合子小鼠造血干细胞的自我更新能力显著降低。我们的研究结果提示Gata2L359V严重干扰Gata2在造血过程中的重要转录调控作用，导致造血干细胞功能发生显著异常。 我们在动物模型上进一步研究了Gata2 L359V突变在CML发病进程中的作用。主要利用我们构建的Gata2 L359V knock-in小鼠模型，采用逆转录病毒技术，结合小鼠造血干细胞移植技术，使BCR/ABL融合蛋白能表达于Gata2 L359V knock-in小鼠骨髓细胞内，协同诱导受体小鼠发病。虽然在Gata2 L359V突变体与BCR/ABL融合蛋白共表达的条件下，并未观察到小鼠慢粒急变表型的发生，但受体小鼠发生类慢粒单白血病的表型，骨髓中单核细胞显著增多，表明Gata2 L359V在BCR/ABL导致的慢性粒细胞疾病的发生过程中发挥了异常作用，改变了有BCR/ABL表达的造血干祖细胞的粒单分化命运。