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目的从中医“祛瘀生新”的角度出发,基于神经干细胞的生物学特点,从在体神经干细胞发生和异体神经干细胞移植两个方面,探讨神经干细胞在缺血损伤修复过程中发挥的作用及机制。方法1孕15-17 d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。2 SD雄性大鼠随机分为5组(n=7):正常对照组(Sham group)、模型组(Model group)、人参皂苷治疗组(Gin group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和人参皂苷治疗同时神经干细胞移植治疗组(Gin+NSCs group)。SD大鼠建立局灶性脑缺血模型,NSCs移植治疗组对建立缺血模型后大鼠缺血侧进行NSCs移植治疗,对缺血7 d后大鼠神经功能改善及脑组织梗死情况进行评估。3基于上述实验分组,收集缺血7 d后大鼠全血及脑组织,制备血清及脑组织匀浆液。采用酶联免疫分析ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性介质,包括炎性细胞因子(IL-lβ,IL-6,TNF-α),趋化因子(CXCL-1,MCP-1),粘附分子(ICAM-1)及一些抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)等,为神经干细胞移植治疗缺血性脑中风的作用机制提供有效证据,并进一步探讨了人参皂苷的抗脑中风机制。4携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,确定慢病毒转染NSCs的最佳转染复数MOI值及最佳转染时间。实验分为4组,设立正常对照组(Shamgroup)、模型组(Model group)、NSCs移植治疗组(NSCs group)和慢病毒转染后HIF-1α基因沉默表达的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)。建立大鼠脑缺血模型后,NSCs移植治疗组(NSCs group)和HIF-1α基因沉默的NSCs移植治疗组(LV-NSCs group)分别在缺血侧侧脑室移植正常NSCs和HIF-1αα基因沉默的NSCs。缺血7 d后,收集血清及脑匀浆液用于测定其炎性相关因子,探讨HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中可能发挥的作用,及其与炎症调节之间的关联。5新生小鼠随机分为4个组:空白对照组(Sham),缺血缺氧模型组(HI),2ME2组(2ME2)和DMOG组(DMOG)。小鼠右侧颈总动脉永久结扎,并进行30min低氧处理,建立缺血缺氧模型。选择2ME2作为HIF-1a蛋白表达抑制剂,DMOG作为PHD的活性抑制剂,即HIF-1a激活剂。通过缺氧/缺血后腹腔内注射后2ME2和DMOG进行干预,采用western bloting技术测定缺血缺氧后新生小鼠脑组织HIF-1a及VEGF表达量。采用western blotting方法测定缺血缺氧后脑组织中caspase 3表达量,研究HIF-1a及VEGF水平对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响。6采用NSCs的特异性标志物巢蛋白Nestin及增殖细胞核抗原PCNA抗体对缺血缺氧大脑SVZ区内的NSCs进行鉴定和增殖标记。基于上述实验分组,采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区神经干细胞增殖情况,并研究HIF-1α和VEGF蛋白水平对SVZ区神经干细胞增殖的影响。7.采用DCX抗体评价神经前体细胞迁移活性,神经元特异性核抗原(NeuN)抗体可标记成熟的神经元。采用免疫荧光双标方法检测缺血缺氧后对新生小鼠大脑SVZ区及皮层神经干细胞分化情况,评价缺血缺氧后,HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层神经干细胞分化的影响。结果1胎鼠海马NSCs分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs,经鉴定,其纯度达95%以上。2各实验组缺血7 d后大鼠神经功能改善、脑组织水肿及梗死情况(1)Model组神经行为评分显著高于Sham组(p<0.05),说明造模成功。人参皂苷治疗组和侧脑室移植NSCs治疗组能显著改善动物局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.05)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同改善大鼠脑缺血后神经损伤效果更明显。(2)缺血损伤后,model组大鼠脑组织出现明显白色缺血区域。人参皂苷和移植神经干细胞均可显著缩小脑缺血面积,减少梗死体积(p<0.01)。人参皂苷和移植NSCs共同进行治疗时,二者有很好的交互作用,协同改善缺血后脑梗塞体积。(3)脑缺血7 d,model组脑水肿率明显大于Sham组(p<0.05),而人参皂苷和移植神经干细胞均可明显改善脑缺血7 d后大鼠的脑水肿情况(p<0.05)。3 ELISA方法测定在血清和组织匀浆液中的炎性相关细胞因子(1)脑组织匀浆液中炎性因子水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的炎性细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)均有显著的提高(p<0.01)。IL-1β水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组IL-1β水平均显著降低(p<0.01)。IL-6水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,但差异无显著性意义(p>0.05)。TNF-αα水平在侧脑室NSCs移植治疗组,人参皂苷治疗组及侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组TNF-α水平均显著降低(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中TNF-α水平。(2)脑组织匀浆液中抗炎细胞因子水平缺血缺氧7 d,model组鼠脑组织匀浆液中的抗炎细胞因子(IL-4,IL-10)均有显著的提高(p<0.05)。IL-4在各个治疗组水平均显著升高(p<0.05)。IL-10水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所升高,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同升高大鼠脑缺血损伤验证级联反应中IL-10水平。(3)大鼠血清中粘附分子水平缺血缺氧7d,model组大鼠血清中的趋化因子(ICAM-1)显著升高(p<0.01)。ICAM-1水平在各个治疗组均降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中粘附分子ICAM-1水平。(4)脑组织匀浆液及血清中趋化因子的水平缺血缺氧7 d,model组大鼠脑组织匀浆液中的MCP-1及血清中CXCL-1均显著提高(p<0.01)。MCP-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组及人参皂苷治疗组有所降低,但无显著性差异(p>0.05),侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组MCP-1水平显著降低(p<0.01)。趋化因子CXCL-1水平在侧脑室NSCs移植治疗组、人参皂苷治疗组、侧脑室NSCs移植同时人参皂苷治疗组均有所降低,差异有统计学意义(p<0.01)。人参皂苷治疗和侧脑室移植NSCs治疗二者之间有较强的交互作用,协同降低大鼠脑缺血损伤验证级联反应中趋化因子CXCL-1的水平。4 HIF-1α在侧脑室移植NSCs进行脑损伤修复过程中发挥的作用(1)慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为转染后144 h。(2)神经功能学评分:侧脑室NSCs移植治疗组能显著改善大鼠局灶性脑缺血后7天的神经损伤症状(p<0.01),LV-NSCs移植治疗组神经行为评分情况与模型组相比,差异无统计学意义(p>0.05),其对缺血后大鼠神经功能改善作用不明显。(3)NSCs侧脑室移植对脑组织匀浆液及血清中炎性相关因子的影响①炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平在LV-NSCs移植组有降低趋势,但差异无统计学意义(p>0.05)。②抗炎细胞因子IL-4在LV-NSCs移植组有所升高,但差异无统计学意义(p>0.05);IL-10水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。③趋化因子MCP-1水平在侧脑室LV-NSCs移植组有所降低,但无显著性差异(p>0.05),CXCL-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。④趋化因子ICAM-1水平在LV-NSCs移植组降低,差异有统计学意义(p<0.01)。5 Western Blot检测新生小鼠皮层中HIF-1α和VEGF蛋白表达量在缺血缺氧条件下,HIF-1α和VEGF蛋白表达量上调。DMOG显著上调缺血缺氧后新生小鼠脑皮层HIF-1α和VEGF蛋白表达量,而2ME2下调HIF-1α和VEGF蛋白表达量。6 DMOG及2ME2对缺血缺氧后新生小鼠大脑皮层凋亡的影响正常状态下,凋亡因子caspase3低表达;缺血缺氧早期,caspase3表达量有所增加,缺血缺氧24 h,caspase 3表达量显著增加,大脑皮层HIF-1α大量表达可能诱导细胞凋亡。7缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区NSCs增殖的影响缺血缺氧后大脑SVZ区HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin双标的阳性细胞数目显著增多,2ME2有效降低了 HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量,DMOG使缺血缺氧后HIF-1α/Nestin、VEGF/Nestin阳性标记细胞数量显著增加。8缺血缺氧后HIF-1α和VEGF蛋白水平对新生小鼠大脑室管膜下区及皮层NSCs分化的影响正常状态下,DCX/PCNA,NeuN/PCNA低表达,缺血缺氧早期,DCX/PCNA表达量有所增加,给予2ME2干预后,缺血缺氧4 h及24 h DCX/PCNA表达量下调,DMOG干预组DCX/PCNA阳性表达细胞明显增多。缺血缺氧2 w,NeuN/PCN表达量显著增加,给予2ME2干预后,NeuN/PCN表达量下调,DMOG干预组NeuN/PCN阳性表达细胞明显增多。结论基于炎症系统,异体移植神经干细胞通过调节炎性相关因子水平发挥了抗脑缺血作用,中药人参皂苷发挥了协同增效的作用。HIF-1α和VEGF蛋白高表达促进了缺血缺氧损伤后脑内神经干细胞的增殖以及分化,促进了神经发生,修复了脑损伤。