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血吸虫病目前仍是危害人畜健康的重要公共卫生问题之一。在我国,日本血吸虫病虽经数十年防治,投入大量人力和财力,疫情仍时有反复,防治效果难以巩固。血吸虫致病主要由于性成熟成虫所产的虫卵在人畜肝脏大量沉积形成虫卵肉芽肿,另一方面,沉积在肠壁的虫卵排出体外是造成该病流行传播的重要途径。因此,控制血吸虫性别分化、性成熟及雌虫产卵成为防制血吸虫病的重要策略,其中血吸虫性别特异性表达产物及功能研究,对血吸虫生殖发生与发育的深入了解及抗血吸虫新药研制都有重要实际意义。RNA干扰(RNAi)技术作为一项新技术以其高特异性、高效性、成本低廉等优点目前已经运用于血吸虫基因功能的研究。我们选择从本室建立的日本血吸虫童虫cDNA文库中筛选出的与模式生物调节雌雄同体性别决定蛋白即决定生殖细胞雄性化作用的Mago nashi样蛋白基因(Genebank登录号BM735619)作为靶基因,构建表达小发夹RNA(shRNA)质粒pSUPER的RNAi系统,为运用RNAi技术鉴定该基因在日本血吸虫性别发育和生殖功能奠定基础。根据日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(序列号为BM735619)作为shRNA的目的基因,利用www.ambion.com/techlib/misc在线软件获得目的序列,经BLAST分析无同种属物种同源序列,分别选取第193-211碱基序列为M1及第464-482碱基序列为M2的特异针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因序列。阴性对照根据M1编码序列随机重排并经BLAST分析无同种属物种同源性序列的1对碱基序列为R。在shRNA两端分别加上BglⅡ和HindⅢ的酶切位点,选取的特异碱基序列与其互补序列之间连以9个核苷酸环,每条链shRNA核苷酸为64个。正向序列:GATCCCC N19 TTCAAGAGA N’19 TTTTTGGAAA ,反向序列:AGCTTTTCCAAAAA N19 TCTCTTGAA N’19 GGG,其中N19即所选特异碱基正向序列,N’19即其反向序列。将设计好的6条寡核苷酸序列交由生物技术公司合成。合成后寡核苷酸通过退火形成双链DNA片段,将其与经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPER质粒连接,构建表达shRNA的重组质粒。由于重组质粒BglⅡ酶切位点丧失,我们选择HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定。空质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后被切下的小片段应为227bp,而重组质粒因插入64bp则被切下的小片段应为291bp。经酶切及测序证实pSUPER构建成功后,纯化重组pSUPER。在BTX电穿孔仪上,经预实验后确定参数为120V电压、20ms脉冲时值、1次脉冲次数,将RNAi质粒电穿孔转染机械化制备日本血吸虫童虫体内,体外培养并分别于电穿孔后第1, 3, 5天收集童虫,按TRIzol方法同时提取童虫的总RNA、DNA及总蛋白。首先以转染的血吸虫童虫DNA为模板,PCR方法扩增表达shRNA质粒中的片段以确定质粒转染的成功;再经实时荧光定量PCR及Western blotting分别检测Mago nashi基因表达水平变化。另外,按相同方法制备的电穿孔RNAi质粒童虫分别肌肉注射BALB/c小鼠两后大腿外侧,饲养6周后剖杀小鼠获取血吸虫成虫,制备成虫整体标本置普通显微镜及激光共聚焦显微镜下观察血吸虫形态及生殖器官结构的变化。结果发现Mago nashi基因的转录水平实验组分别于电穿孔后第1, 3, 5天较对照组(pSUPER-R组)分别下降了7%, 68%, 81% (pSUPER-M1组)及27%, 41%, 66%(pSUPER-M2组)。该基因的蛋白水平在第1, 3, 5天较对照组(pSUPER-R组)分别下降了15%, 25%, 54%(pSUPER-M1组)及18%, 28%, 42%(pSUPER-M2组)。实验结果显示由哺乳动物H1启动子转录的shRNA可以特异性抑制日本血吸虫靶基因和蛋白的表达,短期内(1-5天)效果明显。虽然经小鼠体内获得用RNAi质粒注射的血吸虫成虫形态大小及主要生殖器官的大小,在普通光学显微镜下观察未发现明显变化。但在共聚焦显微镜下可以观察到其形态结构的微细变化,发现实验组部分雄虫睾丸内细胞排列紧密,有大量精子生成,提示Mago nashi基因与其他模式生物一样可能也是血吸虫的性别发育相关基因。