论文部分内容阅读
抗菌肽(antimicrobial peptides)是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，它是生物体内非特异性免疫防御系统中的一种免疫应答产物，它的抗菌谱非常广。双翅目昆虫亮斑扁角水虻能生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明亮斑扁角水虻或者其肠道共生菌对病原微生物有很强免疫力。本文从亮斑扁角水虻自身产生抗菌肽及其肠道细菌两个方面进行研究，发掘新的抗菌肽和肠道抗菌微生物。主要研究结果如下： 根据APD等抗菌肽数据库中昆虫（主要是双翅目昆虫）抗菌肽的保守区序列设计了37对兼并引物进行抗菌肽基因筛查，从经过大肠杆菌和金黄葡萄球菌同时针刺诱导后的亮斑扁角水虻幼虫中扩增出了3类抗菌肽cecropin、sarcotoxin、stomoxyn中的7个基因片段，分别编号为cecropin，sarcotoxin1，sarcotoxin1(a)，sarcotoxin1(b)，sarcotoxin3，stomoxyn，stomoxyn(a)。其翻译后氨基酸序列与对应的原始序列进行比对分析，相似度分别为46.29％、44.44%、46.29%、46.29%、42.55%、46.29%、46.29%。我们同时对7个基因片段进行了生物信息学分析，预测其可能存在的二级结构和三维结构。经预测分析后发现，7个基因片段所预测的蛋白结构与对应原始序列的蛋白有相似的结构也有不同的活性区域。通过序列的比对分析结果及其蛋白的结构预测分析，确定7个抗菌肽基因均为新的抗菌肽基因。 选择抗真菌肽stomoxyn基因进行表达，本实验成功地将stomoxyn基因连接到酵母分泌表达载体pPICZαA上，并在毕赤酵母GS115中进行了表达，实验结果表明在利用1%甲醇诱导72h的时候表达量最高。分离表达蛋白进行抗菌功能检测，结果显示表达的stomoxyn抗菌肽，具有广谱抗菌活性，可抗革兰氏阳性细菌金黄葡萄球菌，革兰氏阴性菌大肠杆菌和真菌稻瘟病病原菌。 另外，我们从昆虫亮斑扁角水虻分离的肠道细菌进行抗植物病原菌的拮抗菌筛选。采用平板对峙法进行抗菌筛选，从亮斑扁角水虻的肠道分离的11株细菌中，筛选出一株对水稻白叶枯病原菌有较强抑制效果的菌株BSF-CL，经生理生化和16S rRNA鉴定和进化树分析确定其种属为枯草芽胞杆菌。参考已知脂肽合成关键基因设计引物，以拮抗菌BSF-CL的总DNA为模板进行PCR扩增，对该菌株可能产生的活性物质进行了分子鉴定。研究结果显示该菌株具有脂肽surfactin和iturin的合成关键基因，推测菌株BSF-CL可以合成两种脂肽iturin和surfactin。另外，根据已经报道iturin与surfactin的抗菌活性可以推测出，抗作物病原真菌如小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌等抑制作用的活性物质可能为iturin和surfactin；但对水稻白叶枯病原菌的抑制作用是首次报道，对其抗菌活性物质还不清楚，需要进一步的研究。 本研究首次进行了亮斑扁角水虻抗菌肽基因筛查，并发现7个新的抗菌肽基因；经毕赤酵母表达的stomoxyn新抗菌肽具有抗细菌和真菌功能。首次从亮斑扁角水虻肠道分离的细菌中鉴定出具有两种广谱抗菌脂肽合成关键基因。这些研究为昆虫亮斑扁角水虻抗菌肽及其肠道微生物抗菌作用机制及抗菌制剂的研究与开发奠定了分子基础。