论文部分内容阅读
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。在美国恶性肿瘤发病率中居第3位，在肿瘤病死率中居第2位。在中国，结直肠癌在恶性肿瘤发病率中排第4位，并有上升的趋势。近年来，肿瘤发生发展的分子机制及靶向治疗倍受关注。间隙连接蛋白几乎存在于哺乳动物的所有组织和细胞中，现已知其家族中有多个成员与癌症的发生发展及转移相关，而Cx29与癌症的关系尚未见报道。通过大数据分析发现Cx29蛋白在结直肠癌组织中的表达量增高，且与患者的预后相关，而他们的作用机制尚不清楚。 目的：运用结直肠癌组织标本以及结直肠癌细胞系，探讨间隙连接蛋白29（Connexin29,Cx29）与结直肠癌发生发展的相关性。 方法：1.运用包含结直肠癌组织、正常组织和淋巴结转移灶（分别48例、42例和41例）的组织芯片（TMA），采用免疫组化技术检测各组织中Cx29表达。并分析结直肠癌组织中Cx29的表达与患者临床病理参数的关系。 2.通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测Cx29在6种结直肠癌细胞系（HCT8，LOVO，HCT116，LS174T，CACO2，RKO）mRNA水平的表达，筛选Cx29高表达和低表达细胞系。 3.采用细胞免疫荧光技术检测Cx29蛋白在结直肠癌细胞的表达部位。 4.构建pEGFP-Cx29过表达质粒，合成Cx29的siRNA，培养HCT116以及RKO细胞系，将过表达质粒和siRNA分别转染入细胞系。运用MTT检测Cx29蛋白对结直肠癌细胞系增殖的影响；运用划痕实验检测Cx29蛋白对结直肠癌细胞的运动和迁移能力的影响；运用Western blotting技术检测Cx29蛋白与Wnt/β-catenin信号通路，AKT信号通路以及EMT过程的关系。 结果：1.细胞免疫荧光和免疫组化结果显示：Cx29蛋白表达定位于细胞质和细胞膜。 2.TMA免疫组化结果以及对患者临床病理参数分析结果显示：Cx29蛋白在结直肠癌组织和淋巴结转移灶中表达量高于正常组织（P＜0.01），且在低分化组织中低表达数量多，在高分化组织中高表达数量多（P＜0.05），而其与患者的年龄、性别、肿瘤的部位和形态、浸润深度以及淋巴结转移无相关性（P均＞0.05）。 3.酶切、测序和Western blotting结果显示Cx29过表达质粒构建成功；q RT-PCR和Western blotting结果显示siRNA成功干扰Cx29蛋白的表达。 4.Western blotting结果显示：与对照组相比，Cx29蛋白干扰后，β-catenin，Axin2，cyclinD1，p-cyclinD1，Snail，Twist，AKT，p-AKT蛋白表达量均减少，GSK-3β，p27-kip蛋白表达量均增多。 5.①MTT结果显示：与对照组相比，干扰Cx29蛋白显著抑制结直肠癌细胞系的增殖，在干扰48和72小时，实验组OD值与对照组比较明显降低（P＜0.05）。②细胞划痕结果显示：干扰Cx29蛋白与对照组相比，细胞的迁移能力被显著抑制。 结论：Cx29蛋白在结直肠癌组织中高表达，且与组织分化程度有相关性。干扰Cx29蛋白的表达抑制结直肠癌细胞系的增殖、运动和迁移能力，其分子机制可能与Wnt/β-catenin信号通路、AKT信号通路以及EMT过程有关。