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从全球范围来看,中国是世界上肝癌发病率最高的国家。目前肝癌的治疗手段主要有手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等,就目前肝癌的治疗情况而言,化学药物治疗肝癌是肝癌治疗的重要手段之一。目前肝癌难以治愈的原因之一为肝癌细胞对抗肝癌药物的耐药性,使得肝癌细胞不能被全部消灭,而导致肝癌的复发、转移；另一原因为新近提出的“肿瘤干细胞学说”,普通的抗肝癌药物只能有效杀伤肝癌细胞,而对肝癌干细胞具有耐药性,导致肝癌干细胞比例在肝癌组织中的比例上升,极易诱发肝癌的复发与转移。针对上述问题,我们提出两种方案：1、利用抗肿瘤药物的联用治疗肝癌,增大抗肿瘤范围,增强肝癌的治愈效果；2、利用抗肝癌干细胞药物杀伤肝癌干细胞,有效防止肝癌的复发和转移。结合两种方案,本课题选择传统的抗肝癌药物与抗肝癌干细胞药物联用治疗肝癌,能够分别选择性作用于肝癌细胞和肝癌干细胞,实现同时杀伤,以期达到肝癌根治的效果。盐霉素(SAL)是一种环醚类的离子载体抗生素,可以选择性作用于多种肿瘤干细胞,包括肝癌干细胞,据报道盐霉素钠(SAL-Na)也具有相似效果。阿霉素(DOX)是治疗肝癌的一种常用化疗药物。本课题将利用纳米脂质体作为药物载体包载抗肝癌干细胞药物SAL-Na和抗肝癌药物DOX,靶向递送至肝肿瘤部位,以达到肝癌的有效治疗的同时降低药物对机体正常组织的毒副作用。成功建立SAL-Na和DOX的HPLC体外含量测定方法学。SAL-Na的线性方程为：A=419.4C-226.7(r2=0.9994),线性范围为：7.8～1000 μg/mL。DOX的线性方程为：A=13814C+192.8(r2=0.9997),线性范围为：0.19～50 μg/mL。经考察,SAL-Na与DOX方法学中药物的线性相关性、特异性、日内精密度、日间精密度、回收率、稳定性等方法学参数均符合药物的含量测定要求。为下一步载药纳米脂质体的包封率、载药量测定及体外释放度的考察奠定了方法学基础。选择四株肝癌细胞系为模型细胞,熟练掌握细胞的培养、传代、冻存和复苏等基本细胞实验的操作,利用无血清悬浮培养技术,从中筛选出HepG2微球体(HepG2-TS)作为肝癌干细胞。通过不同代HepG2-TS的成球率、致瘤能力(肿瘤干细胞鉴定的金标准)、肝癌干细胞表型标记抗体-CD133的表达情况对HepG2-TS作为肝癌干细胞进行了鉴定,结果显示,第3代HepG2-TS的成球率约为肝癌HepG2细胞成球率的2倍,HepG2-TS细胞在裸鼠身上的致瘤能力较肝癌HepG2细胞约强近100倍,HepG2-TS细胞中CD133+的表达率较肝癌HepG2细胞约高5倍。综合上述结果,HepG2-TS可作为肝癌干细胞用于后续实验。通过体外细胞毒性实验,在肝癌细胞系中,SAL-Na对DOX具有增敏作用；SAL-Na与DOX同时作用于肝癌细胞的杀伤效果高于顺序作用的杀伤效果；SAL-Na对HepG2-TS具有选择特异性,而DOX对HepG2-TS具有耐药性,选择性作用于肝癌HepG2细胞；最后,在肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞中筛选出DOX与SAL-Na协同比例为摩尔比1：1,1：5。采用薄膜分散法,成功制备空白纳米脂质体、载盐霉素钠纳米脂质体(SLN)、载阿霉素纳米脂质体(DLN)及按协同比例共载盐霉素钠与阿霉素的纳米脂质体(SDLN),并优化纳米脂质体的处方,选择HSPC:CHOL:DSPE-PEG-2k=85:10:5(摩尔比)作为纳米脂质体的优选处方。通过动态光粒径仪、透射电子显微镜(TEM)对纳米脂质体的表观结构、粒径、Zeta电位进行了表征,结果显示,我们成功制备了分布均匀、粒径在100 nm附近、Zeta电位在-35 mV附近、具有明显脂质双分子层结构的纳米脂质体。依据SAL-Na与DOX在释放介质中的稳定性,分别对载药脂质体的体外释放情况进行了考察,结果显示SDLN、DLN、SLN在72h内均具有一定程度的缓释效果。以DOX作为荧光探针,比较了肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞对载药纳米脂质体与游离药物的摄取情况。结果显示,肝癌HepG2细胞和HepG2-TS对载药纳米脂质体的摄取能力均高于对游离药物的摄取能力,说明纳米脂质体对肝癌细胞和肝癌干细胞具有靶向性。通过细胞毒性实验,考察、比较了空白纳米脂质体载体、载药纳米脂质体与游离药物单用及联用对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性。结果显示,空白纳米脂质体对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞均无明显细胞毒性；载药纳米脂质体可保持游离药物对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性；SLN-DLN、SDLN可保持F-SAL-Na-DOX对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性,说明SDLN-DLN、SDLN可同时作用于肝癌细胞和肝癌干细胞且具有较强的杀伤作用。分别采用HPLC-MS与HPLC分析了SDLN、SLN-DLN及F-SAL-Na-DOX三组处方在SD大鼠体内SAL-Na, DOX的药代动力学特征。结果显示,SAL-Na与DOX缓释效果最优的均为SLN-DLN组,而SDLN组更好的保持了DOX与SAL-Na的包载比例。成功建立HepG2肝癌裸鼠模型,考察了PBS组、Blank liposomes组、F-SAL-Na组、SLN组、F-DOX组、DLN组、F-SAL-Na-DOX组、SLN-DLN组以及SDLN组的体内抗肿瘤活性与系统毒性。结果显示,空白纳米脂质对裸鼠没有明显毒性；其中抗肿瘤活性最佳的为SLN-DLN组与SDLN组且没有明显的系统毒性,抑瘤率分别为76.46+5.49、71.55+5.26%。最后,通过对离体肿瘤进行无血清悬浮培养HepG2-TS,考察了各处方的体内抗肝癌干细胞活性。结果显示,SLN-DLN组与SDLN组均可显著的抑制HepG2-TS的数量及体积,说明SLN-DLN组与SDLN组对肝癌干细胞具有很强的抑制作用。综上所述,SLN-DLN联用与SDLN可以同时作用于肝癌细胞和肝癌干细胞,其抗肝癌活性最优,以协同比例共载两种药物的SDLN可以作为肝癌治疗的有效手段为临床治疗提供新的选择。