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猪圆环病毒II型(PCV2,porcine circovirus type2)与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)以及猪呼吸道疾病综合征(PRDC)等猪病有关,因此PCV2已成为全球养猪业面对的高危病毒。
PCV2的ORF2基因编码Cap蛋白(核衣壳蛋白),该蛋白经其他表达系统表达后会自行组装为类病毒颗粒。对该病毒基因组分析发现,ORF2区高度保守,其编码的Cap蛋白含有PCV2特有的抗原决定簇,该蛋白通过喂食小鼠可以刺激动物免疫系统产生相应的抗体,这说明Cap蛋白具有良好免疫原性。Cap蛋白N端为有一段有41个氨基酸的核定位信号序列,该序列富含稀有密码子,去除该核定位信号的基因序列(dORF2),可提高该基因在大肠杆菌、乳酸菌等原核系统中表达量。因此本研究中采用截去核定位信号的ORF2基因(dORF2)作为目的基因。
乳酸菌是一种无入侵性、无病原性的食品安全级(GRAS)的革兰氏阳性的细菌,被认为是粘膜水平上表达和呈递抗原和药物分子的良好载体。乳酸菌中的乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)因其不定植于动物肠道中,不引起动物的抗药性等特点而受到广泛的认可和运用。本研究采用乳酸乳球菌NICE表达系统来表达PCV2的dORF2基因。
由于不同物种间的基因存在密码子偏爱性(codon preference or bias),因此本研究中除采用野生型dORF2基因(记为dORF2wt),也采用经过密码子修饰及人工合成的dORF2基因(记为dORF2art)来进行表达,以避免密码子偏好性对于dCap表达的影响。
研究结果表明,本研究成功将dORF2wt和dORF2art基因克隆入乳酸乳球菌表达系统中,获得了2株重组乳酸乳球菌,NZ9000-dORF2wt和NZ9000-dORF2art。
诱导表达的结果显示dORF2art在NZ9000/pNZ8048中获得成功表达,同时经Westernblotting检测显示出良好的反应原性。而dORF2wt无明显表达,同时也无明显反应原性。
该结果表明通过采用生物信息学的方法对外源基因进行针对性修饰,有利于提高外源基因在乳酸乳球菌表达系统中表达,同时表达蛋白仍具有生物活性。本研究为提高外源基因在乳酸乳球菌中进行成功表达及提高表达量做了有益的尝试,也为制备抗PCV2口服免疫制剂奠定了基础。