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垂柯霉素(Trichomincin)是本实验室前期从真菌哈茨木霉(Trichoderma hazianum)中分离得到的新结构小分子化合物,已获国家专利,专利号为ZL 200510082974.X。人结肠癌细胞HT-29裸鼠移植模型抗瘤实验证明,垂柯霉素能抑制HT-29裸鼠移植瘤的生长,口服剂量为60mg/kg时抑制率按肿瘤体积计算为62.70%,按瘤重计算为57.44%;不同组间肿瘤组织中细胞因子检测结果显示,与对照组和阳性药物组相比,垂柯霉素组结肠癌肿瘤组织中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor α,TNFα)含量显著降低。然而,垂柯霉素是通过细胞毒性,还是通过调节肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中的细胞因子网络发挥抗肿瘤作用并不清楚。为进一步阐明垂柯霉素抗结肠癌分子机理,本研究采用不同人结肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞、结肠癌相关成纤维细胞(colon carcinoma associated fibroblasts,CAFs)及人急性单核白血病细胞(THP-1,可作为巨噬细胞体外研究的模式细胞),探究垂柯霉素抑制结肠癌的分子机理。垂柯霉素体内药代动力学初步研究结果表明,其最大血药浓度为4.2 μmol/L。根据其血药浓度范围,本研究首先利用MTT测定了在0-10 μmol/L浓度范围内垂柯霉素对结肠癌HT-29、HCT-116和THP-1细胞的细胞毒性,检测结果显示,10 μmol/L垂柯霉素作用上述细胞48h,无明显可见的细胞毒性,说明垂柯霉素体内抗肿瘤作用并不是因其本身的细胞毒性。前期研究证实垂柯霉素处理组肿瘤组织中IL-6及TNFα含量降低,现已有相关研究显示,除肿瘤细胞自分泌外,肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAM)是肿瘤微环境中IL-6及TNFa的主要分泌细胞之一,据此我们采用实时定量PCR(Real-time qPCR)和酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法,进一步分析了垂柯霉素对不同刺激条件下巨噬细胞中IL-6及TNFα的转录和分泌水平的影响。结果显示,不同浓度的垂柯霉素(1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞IL-6及TNFα的转录及分泌,5 μmol/L的垂柯霉素即可发挥抑制作用;10μmol/L垂柯霉素作用时,对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或结肠癌细胞培养上清刺激的巨噬细胞中TNFα及IL-6的转录及分泌的抑制水平均可达到90%以上。因IL-6和TNFα在CRC中分别驱动信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,Stat3)及核因子 κB(nuclear factor κB,NF-κκB),据此进一步采用Western blot方法确定垂柯霉素对结肠癌细胞及其基质细胞中Stat3和NF-κB相关信号通路的影响。结果显示,垂柯霉素以剂量依赖的方式抑制IL-6诱导的不同结肠癌细胞中Stat3信号通路,在10 μmol/L垂柯霉素作用下,HT-29和HCT-116细胞中Stat3磷酸化低于其本底水平,等浓度的垂柯霉素对Stat3磷酸化抑制效果强于Stat3抑制剂BP-1-102;同样,垂柯霉素以剂量依赖的方式抑制TNFα诱导结肠癌细胞HCT-116中NF-κB相关信号通路,而Stat3抑制剂BP-1-102则对NF-κB相关信号通路无作用。垂柯霉素对不同刺激下基质细胞,包括TAM及CAFs中Stat3和NF-κB相关信号通路也有相似的抑制作用,显示其作用靶点及细胞的多样性。为进一步确证垂柯霉素抑制IKK/NF-κB信号通路与Stat3信号通路是直接靶向通路蛋白还是因阻断其中一条通路而引发其他通路被抑制的连锁反应,我们采用siRNA将HCT-116细胞中NF-κB p65基因沉默后,发现垂柯霉素丧失了对p65磷酸化的抑制,却依然能够抑制Stat3的磷酸化,说明垂柯霉素能够分别作用Stat3和NF-κB信号通路的相关靶点。最后,我们初步探究了垂柯霉素对结肠癌细胞及基质细胞中程序性细胞死亡蛋白-1配体(programmed death-ligand 1,PD-L1)表达的影响,研究发现垂柯霉素可以显著抑制PD-L1表达,但垂柯霉素对PD-L1的抑制是直接作用,还是抑制Stat3后引发的连锁反应,有待进一步的实验验证。综上所述,本研究证明,新结构小分子化合物垂柯霉素可以通过靶向抑制肿瘤相关巨噬细胞中促炎因子IL-6、TNFα的分泌,同时抑制结肠癌细胞、肿瘤基质细胞中JAK/Stat3和IKK/NF-κB信号通路,进而遏制结肠癌生长,具有成为新型结肠癌口服治疗药物的潜力。