芹菜素舒张大鼠基底动脉的作用及机制研究

• 作 者: 郭鹏美
• 出 处: 山西医科大学
• 发表日期: 2018年01期
• 关键词: 芹菜素 基底动脉 血管舒张 蛋白激酶 钾通道

目的:1.观察芹菜素（Apigenin）对大鼠离体基底动脉环静息张力及氯化钾（KCl）、血栓素A₂类似物U46619、血管加压素（Vasopressin,VP）和钙离子(Calcium ion,Ca²⁺)的浓度-收缩曲线的影响;2.观察芹菜素的血管作用与细胞内外钙的关系;3.观察芹菜素对KCl(60 mmol·L^-1)、U46619(0.3μmol·L^-1)或VP(3μmol·L^-1)预收缩基底动脉环张力的影响;4.通过观察激酶抑制剂对芹菜素作用的影响,探讨芹菜素的血管作用与蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）、Rho激酶（Rho-associated kinase,ROCK）、细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（p38Mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）的关系;5.通过观察钾通道阻滞剂对芹菜素作用的影响,探讨芹菜素的血管作用与电压依赖性钾通道（Voltage-gated K⁺channels,Kv）、钙激活钾通道(Ca²⁺-activated K⁺channels,K_Ca)、内向整流钾通道（Inward rectifier K⁺channels,Kir）、ATP敏感钾通道(ATP-activated K⁺channels,K_ATP)之间的关系。方法:1.大鼠（成年雄性Sprague-Dawley大鼠,280-320 g）断头处死后立刻打开脑腔取出脑组织,置于4℃、pH 7.40、95%O₂+5%CO₂饱和的生理盐溶液（physiological salt solution,PSS）中,在显微镜下分离出直径约为200-250μm的基底动脉,剪成长大约为2 mm的血管环,用两根直径40μm,长度2 cm的不锈钢丝固定在DMT记录仪上,在37℃、pH 7.40、95%O₂+5%CO₂饱和的PSS中并孵育30 min,用KCl 60 mmol·L^-1连续刺激血管3次。如果相邻刺激所致的收缩幅度差异<10%,并且收缩幅度均>2 mN认为该血管活性良好,然后进行正式实验。实验末,再次用KCl 60 mmol·L^-1刺激血管1次以检验血管活性及药物作用的可逆性。2.利用微血管张力记录系统,观察芹菜素(10、30和100μmol·L^-1)对大鼠离体基底动脉的静息张力的作用,结果以KCl 60 mmol·L^-1的收缩为100%,计算各浓度芹菜素的收缩张力值;观察芹菜素(10、30、100μmol·L^-1)对KCl、U46619、VP、Ca²⁺的浓度-收缩曲线的影响,最后分别以各收缩剂所致的最大收缩为100%,计算加入各浓度芹菜素后张力变化值。3.通过用含乙二醇二乙醚二胺四乙酸（Ethylene glycoltetraacetic acid,EGTA）和无EGTA的无钙溶液各孵育15 min,消除细胞外钙,之后在不含EGTA的无钙溶液中用U46619 0.3μmol·L^-1收缩血管,待血管收缩达到坪台后,加入2.5mmol·L^-1Ca²⁺复钙,待血管收缩达到坪台后洗脱,休息30 min后,预孵芹菜素30μmol·L^-11 20 min,观察芹菜素对U46619 0.3μmol·L^-1在无钙溶液中及复钙时所引起血管收缩的影响。结果以U46619在正常PSS中所致的收缩为100%来计算芹菜素对依赖细胞内钙释放和细胞外钙内流所致收缩成分的影响。4.向浴漕内加入KCl(60 mmol·L^-1)、U46619(0.3μmol·L^-1)或VP(3μmol·L^-1)预收缩血管环,达到坪台后累积加入芹菜素1μmol·L^-1、3μmol·L^-1、10μmol·L^-1、30μmol·L^-1、100μmol·L^-1,观察芹菜素对血管收缩的影响,对照组为血管达到收缩坪台后加入相应体积的二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）以排除溶剂的干扰。最后分别以各收缩剂所致的预收缩为100%绘制芹菜素的浓度-舒张曲线。5.先向浴漕内加入KCl 60 mmol·L^-1或U46619 0.3μmol·L^-1收缩血管,待预收缩达坪台时用芹菜素30μmol·L^-1舒张血管作为正常舒张的自身前对照。冲洗血管环,待血管张力完全恢复后,重复预收缩后芹菜素的舒张实验,但此次在芹菜素舒张前分别加入不同的激酶抑制剂或钾通道阻滞剂。抑制剂孵育血管10 min后加入芹菜素。比较阻断剂存在和不存在条件下芹菜素的舒张强度差异。最后分别以KCl 60mmol·L^-1、U46619 0.3μmol·L^-1所致的收缩为100%,计算芹菜素的血管舒张强度。结果:1.芹菜素(10、30和100μmol·L^-1)对大鼠离体基底动脉静息张力无作用,但使KCl、U46619、VP和Ca²⁺的浓度-收缩曲线右移,并抑制最大收缩（P<0.01）,其IC₅₀值分别为（77.73±1.72）μmol·L^-1、（14.91±1.31）μmol·L^-1、（20.66±1.21）μmol·L^-1和（7.53±1.02）μmol·L^-1。2.芹菜素30μmol·L^-1抑制U46619引起的由细胞内钙释放和细胞外钙内流所介导的收缩,抑制率分别为（24.53±5.32）%和（48.58±8.92）%（P<0.05）。3.芹菜素1-100μmol·L^-1浓度依赖性舒张KCl(60 mmol·L^-1)、U46619(0.3μmol·L^-1)或VP(3μmol·L^-1)预收缩的血管环（P<0.01）,其RC₅₀值分别为（24.27±1.14）μmol·L^-1、（4.1±1.16）μmol·L^-1和（1.9±1.33）μmol·L^-1。4.Go6983(1μmol·L^-1,PKC抑制剂)和PD98059(3μmol·L^-1,ERK1/2抑制剂)减弱芹菜素30μmol·L^-1的舒张作用（P<0.01）,而Y-27632(1μmol·L^-1,ROCK抑制剂)和SB239063(3μmol·L^-1,p38MAPK抑制剂)对其作用无影响（P>0.05）。5.4-AP(0.3 mmol·L^-1,Kv抑制剂)显著减弱芹菜素30μmol·L^-1对KCl、U46619预收缩的舒张作用（P<0.01）。Ba Cl₂(0.3 mmol·L^-1,Kir抑制剂)、TEA(0.3 mmol·L^-1,K_Ca抑制剂)、Gli(0.03 mmol·L^-1,K_ATP抑制剂)均对芹菜素的舒张作用无显著影响（P>0.05）。结论:1.芹菜素(1-100μmol·L^-1)对大鼠基底动脉具有突出的舒张和抑制收缩作用。2.芹菜素(30μmol·L^-1)的血管作用可能与钙拮抗作用有关,其中包括抑制细胞内钙释放和抑制细胞外钙内流。3.芹菜素(30μmol·L^-1)的血管作用可能与改变ERK1/2、PKC活性和激活Kv通道有关。