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卵巢癌发病机制复杂，病理种类繁多，预期生存期短，2018年全球卵巢癌新发病295，414例，死亡184，799例。据美国癌症协会(ACS)统计，卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤。手术及一线化疗能够使部分卵巢癌患者达到临床缓解，但复发率高达70％。而对卵巢癌进展期患者的治疗效果欠佳，总生存率仍不超过20％。浆液性癌占卵巢癌75％，高级别腺癌为最常见的组织学类型，约占卵巢癌70％，预后极差。晚期卵巢癌患者生存期短的主要原因在于复发和耐药。改进晚期卵巢癌的治疗策略，改善患者的生存预后是亟待解决的问题。
程序性死亡因子配体-1（Programmed cell death-ligand1，PD-L1）也被称为表面抗原分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1)，是一种由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1作为PD-1的配体，是最重要的免疫检查点之一，可组成性低表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)和多种非造血细胞，包括血管内皮细胞、胰腺细胞等。炎症性细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素(interferon，INF)以及血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growth factor，VEGF)等可诱导PD-L1表达。肿瘤组织中，PD-L1表达显著升高，除黑色素瘤外，PD-L1还表达于肺癌、结直肠癌以及膀胱癌等各种不同组织来源的肿瘤。PD-L1与其受体PD-1结合，传递抑制信号，可诱导T细胞凋亡、失能，并促进白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的产生，进而抑制肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的激活、增殖和杀伤效应，实现肿瘤免疫逃逸。抗PD-L1信号通路成为抗肿瘤免疫治疗的热点。
同源重组(homologous recombination，HR)修复通路的基凶突变是目前研究的热点，尤其是BRCA1/2突变。聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)抑制剂2014年被FDA批准，用于治疗已接受三种及以上化疗方案且存在胚系或者体细胞乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility geme，BRCA)突变的晚期卵巢癌患者，但局限于BRCA基因突变患者。仅约10％的卵巢癌与遗传基因突变有关，其中75％为BRCA1/2突变。两者的发病风险不同，BRCA1突变者患卵巢癌的终生发病风险为59％，而BRCA2突变者为16.5％[15]。基于多中心大样本的研究数据显示，中国关于BRCA基因突变卵巢癌中生殖细胞BRCA突变率为28.5％，其中BRCA1突变率占20.82％，而BRCA2突变率仅为7.63％，且85.5％已属于Ⅲ/Ⅳ期。而73.0％的BRCA突变卵巢癌患者组织学类型为高级别浆液性癌，这些限制了PARP抑制剂对于卵巢癌的疗效。
本研究以卵巢癌为研究对象，检测协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系，探讨PARP抑制剂联合PD-L1单抗治疗卵巢癌的作用及其潜在机制。
论文第一部分探讨了协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中的表达及其与预后关系。采用免疫组织化学法(IHC)检测77例卵巢癌石蜡包埋组织中PD-L1的表达，取10例卵巢良性肿瘤组织作为对照;x2检验分析卵巢癌组织PD-L1的表达水平与患者临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier法比较不同PD-L1表达水平与患者术后总生存期(overallsurvival，OS)及无进展生存期(progression-free survival，PFS)的关系;激光共聚焦检测肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)中CD4+T、CD8+T细胞与PD-L1的定位与共表达;流式细胞术分析TILs中PD-L1的表达情况。
结果显示：卵巢癌组织（主要在卵巢癌细胞膜和细胞浆）高表达PD-L1，PD-L1在卵巢癌组织的表达与患者的FIGO分期(P=0.026)有关联，而与其他临床病理参数无关（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，PD-L1高表达组较低表达组OS显著缩短，差异有统计学意义(P=0.0005，HR=2.689)。多因素Cox比例风险模型显示，PD-L1高表达(HR=2.275，P=0.023)和FIGO分期(HR=11.229，P=0.024)是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素。按组织分型行分层分析显示，浆液性卵巢癌患者中PD-L1高表达组较低表达组OS显著缩短，差异有统计学意义(P＜0.05）。激光共聚焦显示卵巢癌TILs中，PD-L1+分子分别与CD4+T细胞、CD8+T细胞共表达。流式细胞术分析显示，CD4+PD-L1+平均表达量为36.95％，CD8+PD-L1+平均表达量为23.53％，经Pearson相关性检验分析，卵巢癌组织中PD-L1+表达水平与CD8+T细胞计数呈负相关趋势，但不具统计学意义(P=0.054，r=-0.624)。
论文第二部分探讨了PARP抑制剂联合PD-L1单抗治疗卵巢癌的作用及其潜在机制。采用PARP抑制剂干预卵巢癌细胞株ID8(BRCA野生型、鼠源)，uwb1.289(BRCA突变型、人源)、SKOV3(BRCA野生型、人源)，Western Blot、流式细胞术检测PD-L1表达水平，Western Blot检测信号通路磷酸化水平。siRNA转染敲低PARP/BRCA1/BRCA2表达，Western Blot检测细胞株PD-L1蛋白表达。分别建立uwb1.289、SKOV3细胞与人外周血单个核细胞共培养体系，Transwell Matrigel侵袭法、划痕实验等观察PARP抑制剂联合（或）PD-L1单抗方案对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力的影响。建立uwb1.289细胞与CD8+T细胞共培养体系，BrdU检测细胞增殖情况流式细胞术分析CD8+T细胞周期变化。
结果显示：卵巢癌细胞株ID8、uwb1.289以及SKOV3经不同浓度PARP抑制剂干预后PD-L1表达水平均上调。PARP抑制剂或Anti-PD-L1单抗可抑制卵巢癌细胞侵袭、迁移能力，而联合用药组抑制作用最为明显。siPARP细胞组中的PD-L1表达明显高于亲代细胞而siBRCA1或siBRCA2组，相应PARP诱导的PD-L1表达也下调。在Olaparib干预下，Chk1通路磷酸化水平显著升高，给予Chk1阻滞剂后，Olaparib上调PD-L1效应受到限制。在Olaparib干预下，Chk2、p53和CDC25a磷酸化水平改变不显著，同时给予PD-L1siRNA转染以及Olaparib干预处理，Chk2通路磷酸化水平显著升高，P53蛋白表达量显著升高，CDC25a信号蛋白显著下调。较单独Olaparib干预组，Olaparib联合PD-L1单抗干预显著提高CD8+T细胞增殖能力，及G2-M期CD8+T细胞比例。
论文第三部分在体内验证PARP抑制剂联合PD-L1单抗对卵巢癌的协同抗肿瘤作用。采用皮下接种uwb1.289细胞在BALB/c NOD裸鼠构建卵巢癌移植瘤模型，皮下接种ID8细胞在C57BL/6小鼠构建卵巢癌移植瘤模型，按空白组，Olaparib组，anti-PD-L1组，Olaparib+anti-PD-L1分组处理，绘制肿瘤生长曲线。Western Blot检测肿瘤组织PD-L1表达;IHC检测肿瘤组织Ki67表达。
结果显示：与对照组相比，Olaparib单药组、PD-L1单抗用药组、联合用药组肿瘤生长体积均显著缩小，随着生长周期的延长，差异更加显著。而Olaparib联合PD-L1单抗用药组肿瘤生长体积显著小于单药PD-L1单抗治疗组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。瘤体质量测量结果显示，Olaparib组，PD-L1单抗组，Olaparib+PD-L1单抗组较对照组瘤体质量均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且Olaparib+PD-L1单抗用药组较单药PD-L1单抗组疗效更显著。Olaparib药物干预后移植瘤组织PD-L1水平明显上调。免疫组化染色Ki67标记结果显示，对照组肿瘤细胞增生活跃，分别在Olaparib及PD-L1单抗单药治疗下，肿瘤细胞增生减少，给予Olaparib及PD-L1单抗联合治疗时，肿瘤细胞增生明显被抑制。
综上，协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中高表达，其表达水平与患者FIGO分期及预后密切相关。在卵巢癌细胞中，PARP抑制剂可通过促进Chk1磷酸化诱导PD-L1表达上调。拮抗PD-L可以逆转PARP对CD8+T细胞抑制作用，与PARP抑制剂有协同抑瘤效应。PARP抑制剂联合PD-L1单抗在卵巢癌动物模型中可显著抑制肿瘤的体积及质量，较单药治疗效果显著。
程序性死亡因子配体-1（Programmed cell death-ligand1，PD-L1）也被称为表面抗原分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1)，是一种由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1作为PD-1的配体，是最重要的免疫检查点之一，可组成性低表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)和多种非造血细胞，包括血管内皮细胞、胰腺细胞等。炎症性细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素(interferon，INF)以及血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growth factor，VEGF)等可诱导PD-L1表达。肿瘤组织中，PD-L1表达显著升高，除黑色素瘤外，PD-L1还表达于肺癌、结直肠癌以及膀胱癌等各种不同组织来源的肿瘤。PD-L1与其受体PD-1结合，传递抑制信号，可诱导T细胞凋亡、失能，并促进白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的产生，进而抑制肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的激活、增殖和杀伤效应，实现肿瘤免疫逃逸。抗PD-L1信号通路成为抗肿瘤免疫治疗的热点。
同源重组(homologous recombination，HR)修复通路的基凶突变是目前研究的热点，尤其是BRCA1/2突变。聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)抑制剂2014年被FDA批准，用于治疗已接受三种及以上化疗方案且存在胚系或者体细胞乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility geme，BRCA)突变的晚期卵巢癌患者，但局限于BRCA基因突变患者。仅约10％的卵巢癌与遗传基因突变有关，其中75％为BRCA1/2突变。两者的发病风险不同，BRCA1突变者患卵巢癌的终生发病风险为59％，而BRCA2突变者为16.5％[15]。基于多中心大样本的研究数据显示，中国关于BRCA基因突变卵巢癌中生殖细胞BRCA突变率为28.5％，其中BRCA1突变率占20.82％，而BRCA2突变率仅为7.63％，且85.5％已属于Ⅲ/Ⅳ期。而73.0％的BRCA突变卵巢癌患者组织学类型为高级别浆液性癌，这些限制了PARP抑制剂对于卵巢癌的疗效。
本研究以卵巢癌为研究对象，检测协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系，探讨PARP抑制剂联合PD-L1单抗治疗卵巢癌的作用及其潜在机制。
论文第一部分探讨了协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中的表达及其与预后关系。采用免疫组织化学法(IHC)检测77例卵巢癌石蜡包埋组织中PD-L1的表达，取10例卵巢良性肿瘤组织作为对照;x2检验分析卵巢癌组织PD-L1的表达水平与患者临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier法比较不同PD-L1表达水平与患者术后总生存期(overallsurvival，OS)及无进展生存期(progression-free survival，PFS)的关系;激光共聚焦检测肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)中CD4+T、CD8+T细胞与PD-L1的定位与共表达;流式细胞术分析TILs中PD-L1的表达情况。
结果显示：卵巢癌组织（主要在卵巢癌细胞膜和细胞浆）高表达PD-L1，PD-L1在卵巢癌组织的表达与患者的FIGO分期(P=0.026)有关联，而与其他临床病理参数无关（P＞0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，PD-L1高表达组较低表达组OS显著缩短，差异有统计学意义(P=0.0005，HR=2.689)。多因素Cox比例风险模型显示，PD-L1高表达(HR=2.275，P=0.023)和FIGO分期(HR=11.229，P=0.024)是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素。按组织分型行分层分析显示，浆液性卵巢癌患者中PD-L1高表达组较低表达组OS显著缩短，差异有统计学意义(P＜0.05）。激光共聚焦显示卵巢癌TILs中，PD-L1+分子分别与CD4+T细胞、CD8+T细胞共表达。流式细胞术分析显示，CD4+PD-L1+平均表达量为36.95％，CD8+PD-L1+平均表达量为23.53％，经Pearson相关性检验分析，卵巢癌组织中PD-L1+表达水平与CD8+T细胞计数呈负相关趋势，但不具统计学意义(P=0.054，r=-0.624)。
论文第二部分探讨了PARP抑制剂联合PD-L1单抗治疗卵巢癌的作用及其潜在机制。采用PARP抑制剂干预卵巢癌细胞株ID8(BRCA野生型、鼠源)，uwb1.289(BRCA突变型、人源)、SKOV3(BRCA野生型、人源)，Western Blot、流式细胞术检测PD-L1表达水平，Western Blot检测信号通路磷酸化水平。siRNA转染敲低PARP/BRCA1/BRCA2表达，Western Blot检测细胞株PD-L1蛋白表达。分别建立uwb1.289、SKOV3细胞与人外周血单个核细胞共培养体系，Transwell Matrigel侵袭法、划痕实验等观察PARP抑制剂联合（或）PD-L1单抗方案对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力的影响。建立uwb1.289细胞与CD8+T细胞共培养体系，BrdU检测细胞增殖情况流式细胞术分析CD8+T细胞周期变化。
结果显示：卵巢癌细胞株ID8、uwb1.289以及SKOV3经不同浓度PARP抑制剂干预后PD-L1表达水平均上调。PARP抑制剂或Anti-PD-L1单抗可抑制卵巢癌细胞侵袭、迁移能力，而联合用药组抑制作用最为明显。siPARP细胞组中的PD-L1表达明显高于亲代细胞而siBRCA1或siBRCA2组，相应PARP诱导的PD-L1表达也下调。在Olaparib干预下，Chk1通路磷酸化水平显著升高，给予Chk1阻滞剂后，Olaparib上调PD-L1效应受到限制。在Olaparib干预下，Chk2、p53和CDC25a磷酸化水平改变不显著，同时给予PD-L1siRNA转染以及Olaparib干预处理，Chk2通路磷酸化水平显著升高，P53蛋白表达量显著升高，CDC25a信号蛋白显著下调。较单独Olaparib干预组，Olaparib联合PD-L1单抗干预显著提高CD8+T细胞增殖能力，及G2-M期CD8+T细胞比例。
论文第三部分在体内验证PARP抑制剂联合PD-L1单抗对卵巢癌的协同抗肿瘤作用。采用皮下接种uwb1.289细胞在BALB/c NOD裸鼠构建卵巢癌移植瘤模型，皮下接种ID8细胞在C57BL/6小鼠构建卵巢癌移植瘤模型，按空白组，Olaparib组，anti-PD-L1组，Olaparib+anti-PD-L1分组处理，绘制肿瘤生长曲线。Western Blot检测肿瘤组织PD-L1表达;IHC检测肿瘤组织Ki67表达。
结果显示：与对照组相比，Olaparib单药组、PD-L1单抗用药组、联合用药组肿瘤生长体积均显著缩小，随着生长周期的延长，差异更加显著。而Olaparib联合PD-L1单抗用药组肿瘤生长体积显著小于单药PD-L1单抗治疗组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。瘤体质量测量结果显示，Olaparib组，PD-L1单抗组，Olaparib+PD-L1单抗组较对照组瘤体质量均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且Olaparib+PD-L1单抗用药组较单药PD-L1单抗组疗效更显著。Olaparib药物干预后移植瘤组织PD-L1水平明显上调。免疫组化染色Ki67标记结果显示，对照组肿瘤细胞增生活跃，分别在Olaparib及PD-L1单抗单药治疗下，肿瘤细胞增生减少，给予Olaparib及PD-L1单抗联合治疗时，肿瘤细胞增生明显被抑制。
综上，协同刺激分子PD-L1在卵巢癌组织中高表达，其表达水平与患者FIGO分期及预后密切相关。在卵巢癌细胞中，PARP抑制剂可通过促进Chk1磷酸化诱导PD-L1表达上调。拮抗PD-L可以逆转PARP对CD8+T细胞抑制作用，与PARP抑制剂有协同抑瘤效应。PARP抑制剂联合PD-L1单抗在卵巢癌动物模型中可显著抑制肿瘤的体积及质量，较单药治疗效果显著。