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前言：脑血管疾病是目前严重威胁人类健康的疾病之一,其中缺血性疾病更占多数。脑缺血致脑细胞损伤,当恢复血液灌注后,其缺血性损伤反而进一步加重,我们称其为脑缺血再灌注损伤。其发病机制涉及能量代谢障碍,细胞酸中毒,细胞内钙稳态失衡,氧化应激损伤,兴奋性氨基酸生成,炎症损伤及细胞凋亡等。这些环节彼此重叠,并相互联系,形成恶性循环。
目前认为,急性脑梗死的最佳治疗是尽快溶栓。但溶栓治疗有可能导致脑缺血再灌注损伤,容易引起脑水肿,甚至脑出血,其主要原因是由于血脑屏障(bloodbrain barrier,BBB)通透性增加,血脑屏障由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、基底膜等成分组成,其中相邻内皮细胞问的连接,如紧密连接(tightjunction,TJ)和粘附连接(adhesion junction,AJ)是保持血脑屏障完整性的重要功能单位,是决定血脑屏障通透性的主要因素,其在血管内皮细胞上的分布和/或表达水平影响紧密连接的开放或关闭。我们亟需找到一种在溶栓治疗的同时,尽可能减小再灌注引起的继发性脑损伤,提高临床治疗疗效的有效方法。
血管生成素(angiopoietin,Ang)是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子,最早是从人结肠癌细胞中分离得到的,该蛋白质家族有4个成员:Ang1-4,具有很强的促血管生成活性,Tie-2为其内皮特异性受体。其中血管生成素1(Ang-1)主要发挥保持血管内皮的稳定性,促使血管成熟的作用。研究证实,Ang-1基因缺失或Tie-2基因敲除的小鼠胚胎表现为血管通透性增高,而Ang-1过表达的转基因小鼠血管内皮细胞间及其与周围细胞间的连接完整,没有明显的不良反应。在目前已知的能够促进血管生长的因子中,Ang-1是既能够促进血管再生又能够降低血管通透性的少数因子之一,已用于脓毒血症、移植血管硬化、糖尿病视网膜病变、心肌缺血等疾病的临床前期治疗。Ang-1在正常脑组织中表达很少,脑缺血等病理状态下Ang-1的血浆含量发生改变,血管内皮细胞和血管旁细胞Ang-1的特异表达与脑缺血半暗带血管重建、侧支循环的形成和BBB的完整性密切相关。关于脑缺血与Ang-1表达水平关系的研究表明,局灶性脑缺血的2-4h缺血周围区出现Ang-1mRNA的急性下调,BBB出现明显渗漏;脑缺血后2-28天出现Ang-1 mRNA的上调,BBB渗漏减轻。
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶,在跨膜信号传递过程中起着重要作用。PKC通过催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化,调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。到目前为止,在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类,分为A、B、C三组,A组称为典型或传统的PKC(classical orconventional PKC,cPKC),包括α、βⅠ、βⅡ和γ亚类,,A组成员分子量在76-78kDa。B组为新型PKC(atypical PKC,aPKC),包括δ、ε、η(L)和θ亚类,分子量在77-83kDa。C组为非典型PKC(atypical PKC,aPKC),由ζ和λ亚类组成,分子量较小为67kDa。PKC参与脑缺血再灌注损伤的调节具有亚型特异性,其中PKCα参与介导脑缺血再灌注损伤。
本研究利用局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,颈总动脉注射重组人血管生成素1(以下简称Ang-1),研究局灶性脑缺血再灌注7d内,Ang-1对血脑屏障通透性的影响。
方法：
1、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备。
2、应用激光多普勒血流仪检测局灶性脑缺血前、脑缺血后及再灌注后缺血区脑血流量变化。
3、Zea Longa法检测Ang-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤的影响。
4、氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测脑梗死体积,观察脑组织损伤情况及Ang-1的保护效应。
5、伊文氏蓝(evans blue,EB)检测Ang-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响。
6、RT-PCR法检测Ang-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血区脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin,ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin mRNA的影响。
7、Western blot法检测Ang-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血区脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin,ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin蛋白表达的影响;检测脑缺血区脑微血管内皮细胞PKCα和p-MLC蛋白表达变化。
8、免疫组织化学法检测Ang-1对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血区脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin,ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin蛋白表达的影响。
结果：
1、大鼠局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,Ang-1对缺血区脑组织再灌注期间脑血流量未产生明显影响。
2、大鼠局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,缺血区脑组织血脑屏障通透性显著升高,Ang-1显著降低大鼠缺血区脑组织血脑屏障通透性。
3、大鼠局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,Ang-1显著降低大鼠脑梗死体积。
4、大鼠局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,神经功能出现不同程度的损伤,Ang-1未明显改变神经功能评分。
5、大鼠局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,缺血区脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋occludin和ZO-1及粘附连接蛋白VE-cadherin的mRNA和蛋白表达显著下降,Ang-1显著增加occludin和ZO-1及粘附连接蛋白VE-cadherin的mRNA和蛋白表达。
6、局灶性脑缺血再灌注12h、48h和7d,缺血区脑微血管内皮细胞PKCα和p-MLC蛋白表达显著升高,Ang-1显著抑制局灶性脑缺血再灌注引起的PKCα和p-MLC蛋白表达上调。
结论：
1、局灶性脑缺血再灌注12h、48h、7d,血脑屏障通透性显著增加。
2、Ang-1显著降低局灶性脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的通透性。
3、局灶性脑缺血再灌注条件下,Ang-1未改变大鼠缺血区脑组织再灌注期间的局部脑血流量。
4、Ang-1对局灶性脑缺血再灌注引起的神经功能未产生明显的影响。
5、Ang-1显著上调局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血区脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin、ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin表达。
6、Ang-1显著抑制脑缺血再灌注缺血区脑微血管内皮细胞PKCα和p-MLC蛋白的表达上调。