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目前,临床器官移植取得了显著的进步,器官移植后短期(1年)存活率达到90%以上;但是,长期存活率仍不理想。其原因主要是由于慢性排斥反应以及非特异性的免疫抑制药物的毒副作用引起。如何让器官移植受者在不使用或少使用免疫抑制药物的前提下,对移植器官不产生免疫识别和/或免疫攻击,也就是特异性针对移植器官免疫耐受,是目前移植医学难题之一。在移植免疫耐受机制的研究中,CD4~+CD25~+调节性T细胞(Tregs)的作用越来越受到大家的重视。Tregs是一类高表达CD25和叉头/翼形螺旋状转录因子(Foxp3)的CD4~+T细胞,具有很强的免疫抑制功能。研究表明,输注Tregs可控制移植物抗宿主病和移植排斥反应的发生。然而,体内天然产生的Tregs在正常生理状态下,仅占外周血单个核细胞数量的1%,与效应T细胞不同,它们被T细胞表面受体(TCR)激活后仍保持无能状态,极低增殖;而且目前尚无有效的手段诱导体内Tregs大量扩增。显然,为了达到治疗目的,必须在体外大量扩增Tregs再输回患者体内。如何扩增Tregs以用于诱导器官移植免疫耐受,是目前移植医学研究的热点问题之一。白介素15(IL-15)是1994年由Burton和Grabstein同时发现的一种细胞因子。由于IL-15与IL-2结构中均含4α螺旋结构, IL-15与IL-2一起共享IL-2受体β和γ链(IL-2Rβγ/γc),有学者将IL-15归类于IL-2细胞因子家族,二者对T细胞作用后的许多效应有相同之处。不同在于IL-15主要以与IL-15Rα链高亲和力结合状态存在,即使缺乏IL-2Rβ和IL-2Rγ/γc受体亚单位,IL-15与其受体α私有链仍有着高度的亲和力(Ka≥1011M-1);而在缺乏IL-2Rβγ时,IL-2与IL-2Rα的亲和力却很低(Ka～108M-1)。体外实验表明,IL-2扩增Tregs的能力优于IL-15,然而IL-2或者IL-15缺陷小鼠体内Tregs数量和功能轻度下降或正常,只有当二者均缺陷时才会出现Tregs数量和功能显著下降。表明IL-15在Tregs的扩增中同样发挥重要作用,但IL-15是如何发挥作用还有待于进一步研究。Rachael等将IL-15、表皮成纤维细胞各自单独与Tregs培养时不能增殖Tregs,但将二者联合后却能显著增殖Tregs,提示IL-15在其他细胞存在的条件下才能发挥增殖Tregs的作用。既往研究表明IL-15联合表皮成纤维细胞促进活化的T细胞增殖时主要是由表皮成纤维细胞以膜结合的形式向T细胞递呈IL-15。在免疫反应的启动中,树突状细胞(DC)是功能最强的激活初始T细胞的抗原递呈细胞,与表皮成纤维细胞一样,DC也能以膜结合的形式向靶细胞递呈IL-15。DC是否同样可以以膜结合的形式向Tregs细胞递呈IL-15而诱导Tregs增殖尚不清楚。因此,本研究从人外周血中分离出Tregs,随后将IL-15、DC单独或联合干预Tregs的生长,从分子水平探讨IL-15和DC对Tregs的作用及机制,为体外更好地扩增Tregs以得到足够数量的Tregs用于诱导器官移植免疫耐受奠定实验基础。我们将本研究主要方法、获得的主要结果和结论归纳如下:一、树突状细胞与CD4~+CD25~+调节性T细胞的分离及鉴定。1.人外周血贴壁的单核细胞经GM-CSF~+IL-4联合诱导,于第6天负载同种异体抗原,培养第7天收集获得的细胞,光镜、电镜观察细胞的形态;流式细胞仪检测细胞表面标志物;将所得细胞经丝裂霉素灭活后与自体CD4~+CD25-T细胞混合淋巴细胞培养72h,3H-TdR掺入法检测CD4~+CD25-T细胞的增殖。结果显示,所得细胞逐渐由贴壁变成悬浮,细胞形态不规则,表面粗糙,有大量层叠状皱襞和毛刺状突起,表达共刺激分子CD80、CD86,MLR显示能刺激自体CD4~+CD25-T细胞增殖。表明所得细胞具有DC的细胞形态、免疫表型及功能特性,说明实验中建立的分离培养DC的方法是可行的。2.人外周血单个核细胞经免疫磁珠阴性分选和阳性分选,将获得的细胞经台盼蓝染色检测细胞的活力;流式细胞仪检测细胞的纯度和细胞表型;将所得细胞经丝裂霉素灭活后与自体CD4~+CD25-T细胞混合淋巴细胞培养,包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激72h,3H-TdR掺入法检测CD4~+CD25-T细胞的增殖。结果显示所得细胞活力为(95. 7±2.1) %,纯度为95.2%,胞内因子Foxp3在Tregs细胞的表达率为94.2%,在体外能抑制致敏T淋巴细胞增殖。表明所得细胞具有Tregs的细胞表型及功能特性,说明本实验建立的方法可以在体外分离出Tregs,为进一步研究Tregs打下基础。二、IL-15和树突状细胞诱导增殖后CD4~+CD25~+调节性T细胞的表型与功能1.Tregs按1×104/孔置于U型底96孔板中,依据每孔加入的DC(1×104/孔,经丝裂霉素灭活)或包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠(1×104磁珠/孔)不同分为四大组:负载同种异体抗原的DC~+IL-2组(简称DC~+IL-2组)、负载同种异体抗原的DC~+IL-15组(简称DC~+IL-15组)、包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠~+IL-2组(简称CD3/CD28~+IL-2组)和包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠~+IL-15组(简称CD3/CD28~+IL-15组),各组内依据细胞因子浓度不同分为0、25U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml等小组,各小组3复孔。培养第5天,3H-TdR掺入法检测Tregs增殖。结果显示在包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激下,IL-15在0---100U/ml的浓度范围内,基本不引起Tregs增殖,至200U/ml浓度时,可引起Tregs轻度增殖;而在包被抗CD3/CD28抗体的Dynal磁珠刺激下,IL-2在25U/ml浓度时即可引起Tregs显著性增殖(较同等浓度的IL-15);在负载同种异体抗原的DC刺激下,IL-15和IL-2一样,在0---200U/ml的浓度范围内,成剂量依赖性诱导Tregs增殖,且在100U/ml和200U/ml浓度时,二者诱导Tregs增殖的幅度无显著性差异。说明在DC存在的情况下,IL-15也能诱导Tregs增殖。2.从培养体系中免疫磁珠阳性分选出CD4~+T细胞,流式细胞仪检测该细胞的纯度、细胞表型和CD62L;3H-TdR掺入法检测该细胞对CD4~+CD25-T细胞的增殖的抑制作用。结果显示,DC跨细胞递呈IL-15增殖的Tregs纯度高,仍具有典型的CD4~+CD25~+Foxp3~+表型特征,在体外对特异性同种异体抗原激活的Teff增殖的抑制功能强,对第三方同种异体抗原激活的Teff的免疫抑制功能弱,且Tregs高表达CD62L。说明DC跨细胞递呈IL-15增殖的Tregs具有天然Tregs的细胞表型,具有的特异性抑制作用,具备到达特定的作用部位发挥作用的能力。三、IL-15和树突状细胞诱导CD4~+CD25~+调节性T细胞增殖的作用机制1.将Tregs和DC分别与浓度为100U/ml的IL-15在37℃细胞培养温箱中孵育15分钟后流式细胞仪检测细胞表面IL-15,而细胞表面IL-15Rα则直接检测。结果显示,Tregs细胞表面IL-15Rα的表达极低,基本上未在Tregs细胞表面检测到结合的IL-15;而DC细胞表面IL-15Rα的表达较高,DC表面结合的IL-15远远高于在Tregs细胞表面结合的IL-15(p<0.05)。表明Tregs直接结合IL-15的能力较低,而DC直接结合IL-15的能力较高,特殊ELISA证实DC细胞表面确实形成了IL-15-IL-15Rα复合物。2.将负载同种异体抗原的DC与Tregs按1:1比例混合培养,培养液中加入IL-15 100U/ml,24h后收集混合培养的细胞于离心管中,分别用PE-抗CD86和FITC-抗CD4标记DC和Tregs。激光共聚焦显示将DC、Tregs与IL-15共培养后,DC与Tregs间形成稳定的细胞团,这些提示DC和IL-15可能通过由DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。3.DC和Tregs各以1×105/孔共同培养于平底96孔板,依据是否加入Anti-IL-15Rα不同将实验分为对照组和阻断组:两组均加入100U/ml的IL-15;不同之处在于阻断组在加入IL-15之前先加入40ug/ml的Anti-IL-15Rα,而对照组加入等体积的PBS。两组均在培养的第5天收集细胞、匀浆,特殊ELISA检测IL-15-IL-15Rα复合物。Tregs和经丝裂霉素灭活的DC各以1×104/孔共同培养于U型底96孔板,实验分组及处理同前。在培养的第5天收集细胞,3H-TdR掺入法检测Tregs增殖。结果显示,用IL-15Rα抗体预处理DC后再与与IL-15孵育, DC细胞表面IL-15-IL-15Rα复合物下降,此时Tregs增殖亦显著减少。从反面证实DC和IL-15主要是通过由DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。4.在不同时间点检测DC表面IL-15:将DC置于含100U/ml的IL-15的培养液中培养4天,流式细胞仪检测DC表面IL-15;收集细胞,在甘氨酸缓冲液(PH=3)孵育,10分钟后检测DC表面IL-15;再将DC重新培养于无细胞因子的培养液中继续培养24h,流式细胞仪检测DC表面IL-15。DC和Tregs各以各1×105/孔共同培养于平底96孔板,依据处理方式不同将实验分为三组:对照组、维持组、撤退组。三组中对照组不加IL-15;维持组和撤退组均加100U/ml的IL-15,但撤退组于共培养的第4天撤退IL-15再培养24h,而维持组不撤退IL-15。三组均在培养的第5天收集细胞、匀浆,特殊ELISA检测IL-15-IL-15Rα复合物。经丝裂霉素灭活的DC和Tregs各以各1×104/孔共同培养于U型底96孔板,同时加入100U/ml的IL-2或IL-15依据是否在细胞培养的第4天撤退细胞因子分为维持组(不撤退)和撤退组。将细胞继续24h,3H-TdR掺入法检测Tregs增殖。结果显示,在培养体系中撤退IL-15后24h流式细胞仪仍能在DC表面检测到IL-15,培养体系中仍有IL-15-IL-15Rα复合物形成,Tregs可以继续增殖。说明IL-15还可在DC跨胞内体再循环,从而使IL-15持续长时间存在于DC细胞表面,继续通过DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。5.将Tregs和DC各1×104/孔共同培养于U型底96孔板,依据是否加入浓度为100U/ml的IL-15分两组:实验组加入IL-15,而对照组不加入IL-15。于细胞培养的第1、2、3、4、5天取上清液ELISA检测IL-2浓度。结果显示,对照组IL-2浓度无明显变化,而实验组IL-2浓度显著性较对照组高,于细胞培养的第四天达到顶峰。但是其峰值仅约60pg/ml,从实验中我们可以看出,此浓度下Tregs基本上无明显增殖,表明在培养体系中IL-15确实调节DC分泌IL-2,但此作用在DC和IL-15诱导Tregs增殖的过程中不起主导作用。6.实验中重悬细胞的培养液含100U/ml的IL-15,将含Tregs总数为4×104的细胞悬液600μl置于24孔板,依据是否使用Transwell小室将实验分为对照组和实验组,每组3复孔:实验组加上滤膜孔径为3.0um的Transwell小室,小室内再加入含DC总数为4×104的细胞悬液100μl;而对照组直接将含经丝裂霉素灭活的总数为4×104的DC细胞悬液100μl加入24孔板,与Tregs共培养。第5天收集24孔板内细胞,台胎盘蓝染色后直接在光镜下计数。结果显示,使用Transwell小室的实验组基本不增殖,而不加Transwell的对照组显著性增殖,p<0.05。表明在IL-15和DC诱导Tregs增殖的过程中,IL-15与DC作用形成的IL-2和sIL-15-IL-15Rα不起主要作用。7.Tregs以5×104/孔培养于U型底96孔板中,依据加入经丝裂霉素灭活的DC(5×104/孔)和IL-15(100U/ml)不同分为五组:对照组、DC组、IL-15组、联合诱导组和联合诱导阻断组。其中,对照组不加IL-15和DC;DC组仅加DC;IL-15组仅加IL-15;联合诱导组同时加DC和IL-15;联合诱导阻断组先加入加入40ug/ml的Anti-IL-15Rα和DC,然后再加入IL-15。培养24h后收集细胞、提取蛋白。Western-Blot检测CD4~+CD25~+调节性T细胞p-ERK、p-AKT、p-STAT5和P27kip1的表达。结果显示:DC介导的活化能成功诱导Tregs内PI3K的靶分子Akt活化但不能诱导MEK1/2的靶分子Erk1/2的活化,也不能诱导STAT5的活化和p27kip1的降解;而单独加入外源性IL-15后,由于Tregs的IL-15Rα低表达,IL-15并不能显著诱导Tregs的Akt、Erk1/2和STAT5的活化以及p27kip1的降解;只有同时加入DC和IL-15,才能显著诱导Tregs的Akt、Erk1/2和STAT5的活化以及p27kip1的降解,引起Tregs增殖。此外,加入Anti-IL-15Rα后再加入DC和IL-15,Tregs的Akt、Erk1/2和STAT5的活化以及p27kip1的降解被抑制,Tregs增殖下降,进一步说明DC和IL-15主要以跨细胞递呈方式诱导Tregs增殖。结论一、成功建立了从人外周血分离培养DC和Tregs的方法。二、在DC存在的情况下,IL-15也能大量诱导Tregs增殖。DC和IL-15诱导增殖的Tregs纯度高,具有天然Tregs的细胞表型,具有特异性抑制作用,具备到达特定的作用部位发挥作用的能力,有用于临床诱导移植免疫耐受的潜力。三、DC和IL-15诱导Tregs增殖的作用形式主要是通过由DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。IL-15还可在DC跨胞内体再循环,从而使IL-15持续长时间存在于DC细胞表面,继续通过DC跨细胞递呈IL-15给Tregs而诱导Tregs增殖。此外,IL-15调节DC分泌IL-2可能在DC和IL-15诱导Tregs增殖的过程中起辅助作用。四、DC和IL-15诱导Tregs增殖,其分子机制可能是通过Tregs的Akt、Erk1/2和STAT5的活化以及p27kip1的降解。