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研究背景及目的随着现代社会的发展,环境的破坏和污染,雾霾之下,肿瘤已经成为危害人类健康的主要疾病之一。尽管传统的治疗方式像手术、放疗、化疗和免疫疗法,在很大程度上改善了患者的病征,但仍然存在诸如形体创伤较大、毒副作用强,安全性差这些问题。尤其是对于像脑部肿瘤,手术、放化疗不是最好的选择。因此,探寻能够实现肿瘤靶向、有效且安全的治疗方式是现在生物医学亟待解决的问题。1989年日本学者在光动力的基础上提出利用低强度超声激活光敏性物质杀伤肿瘤的设想,即“声动力学疗法Sonodynamic therapy (SDT)"。该疗法指注射声敏剂后,声敏剂在肿瘤组织特异性富集,之后采用超声进行靶向辐照,产生声化学反应杀伤肿瘤细胞。与高强度超声相比,低强度超声具有能够避免局部高温损伤及机体的炎症反应的优点。声敏剂能够特异性富集于肿瘤组织,对正常组织的毒性小,尤其是具有自发的荧光,这有利于治疗过程的定位、成像和监测。超声设备造价相对低、易操作。超声作为一种非辐射的能量传递形式,因其穿透性强且靶向聚焦等优点,已经被人们尝试用于肿瘤的治疗研究中,并取得了明显的疗效。因此,声动力具有潜在的靶向、安全有效等优势。在SDT治疗肿瘤的研究中发现,声敏剂是影响抗癌疗效的关键要素之一。本研究所选声敏剂是由中国医学科学院药物研究所方起程教授研究团队制备的纯度为98.7%以上的卟啉二聚体钠盐华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium代号DVDMS)。前期研究结果显示DVDMS具有水溶性好、化学性质纯、暗毒性低而光毒性强、单线态氧产额高等优势,特别是具有我国自主知识产权、质量可控能够产业化生产。现阶段有关声动力学疗法的研究主要集中在声动力的理化作用机理、超声装置以及声敏剂的研发和优化,而对于声动力学疗法的处理模式对治疗效果的影响却少有人探讨。由于DVDMS是一新研发的敏化剂,目前关于DVDMS介导的声动力的文献报道主要是关于其声敏活性及作用机制的研究,还未有研究探讨DVDMS介导的超声处理模式是否会对其治疗效果产生影响。本课题拟探讨不同次数的超声激发聚集在肿瘤组织内DVDMS是否对其治疗效果产生影响,以期为DVDMS联合超声治疗提供可能的最优处理模式,为DVDMS的新药研发及SDT治疗肿瘤提供理论依据。研究方法及结果第一部分DVDMS对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应研究实验主要采用流式细胞仪、精诺真活体成像和MTT法对DVDMS在正常细胞和肿瘤细胞中富集情况以及细胞毒效应进行了研究。实验结果如下：①不同浓度的DVDMS与S180细胞共孵育3h时在细胞中的富集量最大,因此细胞实验选择3h作为DVDMS孵育时间。②同等条件下DVDMS本身的荧光强度明显高于比其他卟啉类敏化剂,相对于正常细胞DVDMS更能有效地富集于肿瘤细胞。③相同剂量的DVDMS对肿瘤细胞的细胞毒作用显著高于正常细胞。第二部分DVDMS-SDT对小鼠S180细胞杀伤作用及血管形成效应研究实验主要采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞仪结合AnnexinV-PE/7-AAD以及HUVECs体外小管形成实验研究了DVDMS-SDT对S180细胞的增殖抑制和HUVECs体外小管形成抑制效应。实验结果显示：①0.05μM的DVDMS对S180细胞基本不具有毒性作用,当其联合超声处理后,细胞存活明显降低,并且具有超声时间的依赖性,提示DVDMS能够有效被超声激活；并且同等处理条件DVDMS-SDT对正常细胞SPL基本无杀伤作用；克隆形成实验证明DVDMS-SDT可显著抑制S180细胞的增殖。②DVDMS-SDT处理后,流式细胞仪结合AnnexinV-PE/7-AAD检测发现,DVDMS联合超声可诱导S180细胞凋亡,且凋亡率随超声时间的延长而增加。③DVDMS介导的声动力能够显著抑制HUVECs体外小管网络的形成,提示DVDMS-SDT在杀伤肿瘤血管中发挥关键作用。第三部分DVDMS在S180荷瘤小鼠体内及肿瘤部位的代谢研究实验采用小动物活体成像技术对DVDMS在S180荷瘤小鼠体内的分布及代谢进行研究。研究结果显示：DVDMS经尾静脉注射后能够很快富集于肿瘤组织,给药后2小时,DVDMS在肿瘤部位内的荧光强度达到最大；2-6h间荧光强度基本保持不变(6h时DVDMS在肿瘤部位的荧光强度为2h的98.77%),随后缓慢下降,24h的药物荧光强度为最大值的70.37%。因此我们可以利用2-24小时DVDMS在肿瘤部位潴留的特点进行间歇式多次光照或超声处理,提高敏化剂在肿瘤部位的利用率以达到更高的抑瘤效果。第四部分DVDMS介导的多次超声治疗对S180移植瘤的杀伤作用研究通过建立S180荷瘤小鼠模型,分别从肿瘤体积、肿瘤重量、小鼠体重、主要脏器观察、切片形态学观察、免疫组化等几个方面探讨了DVDMS介导的多次声动力疗法对S180移植瘤的生长抑制及血管杀伤效应。实验结果表明：①DVDMS介导的多次超声治疗能显著抑制小鼠肿瘤的生长(瘤重抑瘤率高达89.82%),且肿瘤抑制率具有超声次数依赖性。②TUNEL检测结果显示DVDMS介导的多次声动力治疗能够杀伤肿瘤组织诱导肿瘤细胞发生凋亡。③DVDMS介导的多次声动力治疗后,多次声动力处理组微血管密度及血管内皮生长因子VEGF表达量显著下降。④2mg/Kg DVDMS介导的多次声动力处理对小鼠体重无明显影响,主要脏器无明显毒副作用,提示DVDMS介导的多次超声处理模式是相对安全可靠的。结论综上所述,本课题的探究在细胞实验和动物实验水平两个方面证实了DVDMS联合多次超声处理是一相对安全、可重复、容易操作、经济、无创和无毒的处理模式,其介导的多次声动力治疗能有效抑制S180肿瘤细胞增殖、促进S180细胞凋亡和杀伤肿瘤血管,并且多次声动力处理效果明显优于单次超声和单次声动力处理。间歇式多次处理模式不仅提高了DVDMS在肿瘤内的利用率增强抗肿瘤效果,而且为其临床应用提供了可能的最优处理模式和理论依据。