催产素受体的多聚化研究

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目的:研究催产素受体在体外培养细胞和动物体内的存在形式,探讨第112位、187位半胱氨酸残基对催产素受体多聚体、催产素受体内吞和催产素受体与配体结合力的影响。方法:运用免疫沉淀和免疫印迹方法研究催产素受体的存在形式,用点突变方法突变第112位、187位半胱氨酸残基,然后运用免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光和放射配体结合试验等方法研究突变体对催产素受体多聚体、催产素受体内吞和催产素受体与配体结合力的影响。结果:⑴ 文献报道催产素受体单体表观分子量约47kDa,糖基化后分子量为55kDa~80kDa不等。本文 检测到表达于CHO细胞、从Wistar大鼠脑与子宫制备的催产素受体在高浓度SDS(8%)、非还原环境中均以四聚体(MW:244kDa)、三聚体(MW:183kDa)和二聚体(MW:122kDa) 组成的多聚体为主,单体很少;在高浓度SDS(8%)、还原环境(含DTT或β-ME)中多聚体全部解聚,只有单体(MW:61kDa)。⑵ 突变第112位、187位半胱氨酸残基后,催产素受体在高浓度SDS(8%)、非还原环境中仍然以四聚体(MW:244kDa)、三聚体(MW:183kDa)和二聚体(MW:122kDa) 组成的多聚体为主,单体很少;在高浓度SDS(8%)、还原环境(含DTT或β-ME)中多聚体全部解聚,只有单体(MW:61kDa)。⑶ 在放射配体结合试验中,野生型<WP=6>催产素受体与拮抗剂125I-OVT有很好的结合(Kd=147.9pM),但三个突变体与拮抗剂125I-OVT几乎都没有结合(m112187、m112、m187的Kd值分别为:1.15×1012 pM,1.12×1012 pM, 1.16×1012 pM),在野生型催产素受体中加入DTT后受体与拮抗剂125I-OVT也没有结合(Kd=1.35×1012 pM)。⑷ 野生型催产素受体在激动剂刺激30min后大部分内吞,但三个突变体(分别突变第112位、187位半胱氨酸残基和同突变第112位、187位半胱氨酸残基)在激动剂刺激相同时间后不出现内吞,野生型催产素受体加入DTT后在激动剂刺激相同时间后也不出现内吞。结论:⑴ 催产素受体在体外培养细胞和动物体内的存在形式均以多聚体为主。⑵ 催产素受体多聚体单体间以共价键(二硫键)结合。⑶ 催产素受体形成的是同源多聚体。⑷ 第112位、187位半胱氨酸残基对催产素受体多聚体的形成没有影响。⑸ 第112位、187位半胱氨酸残基对催产素受体与配体结合有关键性作用。⑹ 第112位、187位半胱氨酸残基对催产素受体内吞有重要作用
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