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目前在世界范围内，肿瘤仍是一种高发的致死性疾病，化疗是肿瘤治疗的三大手段之一，但肿瘤对抗癌药物产生的耐药性是导致化疗失败的主要原因。另外，化疗的作用机理是依耐肿瘤细胞与正常细胞在生长、修复、死亡的动力学差异，因此化疗药物不可避免地会影响正常细胞，带来多种不良反应而限制其临床应用。如果想要进一步提高肿瘤的治愈率，必须从分子水平上深入研究化疗药物在正常细胞和肿瘤细胞当中的作用机制，近年来对于高效低毒的化疗药物的开发和应用已成为研究热点。现阶段研究一般认为，化疗药物的疗效主要是由于它能够诱导肿瘤细胞的凋亡，然而细胞也可以通过自噬性细胞死亡，坏死或有丝分裂灾难等形式死亡。其中，自噬性死亡是目前的研究热点，先前的实验表明很多化疗药物能够在不同的肿瘤细胞当中诱导自噬发生，包括拓扑替康，多柔比星，VP-16，环磷酰胺，顺铂，替莫唑胺，吉西他宾，紫杉醇及5-FU等，然而化疗药物诱导的自噬究竟是促进还是抑制肿瘤细胞的死亡目前还不很清楚。拓扑替康(Topotecan，TPT)是一种新型喜树碱半合成衍生物，通过抑制细胞存活中一种必需酶：DNA拓扑异构酶Ⅰ，从而阻碍断裂DNA单链的重新连接，最后使DNA复制停滞，导致细胞死亡。近来研究表明，TPT的特殊作用机制决定了它与其他药物联用能够有效的提高治疗效果。氯喹(Choroquine，CQ)是一种常见的抗疟疾药物，也应用于类风湿性关节炎，盘状红斑狼疮及阿米巴肝炎的治疗。1992年Djordevic等报道：应用CQ治疗小鼠黑色素瘤能够增强放疗所诱导的细胞死亡。因此，氯喹被认为具有直接的细胞毒性作用，或能够间接的增强放、化疗的敏感性。后续的研究表明在不同的肿瘤细胞如：乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤等当中，氯喹均具有直接细胞毒性作用。近来，一项随机、双盲、安慰剂对照的临床研究表明，氯喹联合应用传统的放疗及化疗能够有效延长多形性恶性胶质瘤的中位生存时间。到目前为止，有十几个不同的关于CQ增敏放、化疗的临床试验正在进行当中。
目的：观察CQ与化疗药物TPT联用对于肿瘤细胞增殖抑制的影响，并初步探讨其可能机制。
方法：应用MTT法检测TPT对肺癌细胞A549和结肠癌细胞SW480、SW620、Colo205、LoVo的增殖抑制作用，以及CQ和TPT联合应用时对A549和LoVo细胞的增殖抑制作用；共聚焦显微镜下观察胞质内YFP-LC3的点状聚集及AO染色的酸性小体；采用shRNA沉默Atg5后应用TPT处理，MTT法检测对A549的生长抑制，采用siRNA沉默Beclin1后应用TPT，台盼蓝染色法计数LoVo细胞死亡率。通过流式细胞仪检测CQ和TPT联用对于A549细胞的细胞周期，凋亡率及SP细胞比例的影响。应用免疫印迹方法(Western Blot)检测细胞自噬、凋亡相关蛋白的变化，以及自噬相关基因Atg5，Beclin1和LC3的蛋白表达水平。
结果：
⑴应用浓度为0-25μg/mL TPT处理A549细胞48h或72h，通过MTT检测可发现TPT对A549细胞的生长抑制呈现时间及浓度依赖性，在72h，IC50值为1.776±0.25μg/mL，同样应用MTT法检测CQ(0.39-6.25μg/mL)与TPT(3.9-62.5μg/mL)联用对A549细胞的增殖抑制作用，通过软件分析在上述浓度范围内，两药联用的CI值均＜1，说明CQ能够增强TPT对A549细胞的增殖抑制作用。
⑵采用流式细胞术及免疫印记法检测两药联用对于细胞凋亡的影响。首先，通过annexin V-FITC/PI双染经药物处理48h的细胞，可发现单用2μg/ml TPT处理时，annexin V(+)细胞为17.0％，当与10μg/ml CQ联用时，annexin V(+)细胞增多至32.8％；其次，通过细胞周期分析，检测sub-G1期细胞的比例，可发现单用2μg/ml TPT处理时，处于sub-G1期细胞比例为11.4％，当与10μg/ml CQ联用时则增多至23.1％；另外，通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白PARP可发现联用CQ后，能够明显增加TPT所引起的细胞断裂带水平，这些数据说明，CQ能够增强TPT所诱导的A549细胞的凋亡。
⑶采用流式细胞术检测药物TPT和CQ对A549中SP细胞比例的影响，结果发现，0组细胞当中SP细胞的比例为12.2％，当应用0.3μg/ml TPT处理时SP细胞的比例降至9.1％，当应用5μg/ml CQ处理时SP细胞的比例降至8.1％，两药联用时SP细胞的比例则降至6.9％，结果表明CQ能够增强TPT对SP细胞的抑制作用。
⑷使用2μg/ml TPT处理稳定转入YFP-LC3的A549细胞12小时后,应用共聚焦显微镜可以观察到细胞中的绿色荧光由弥散分布转变为明显的点状聚集，提示LC3在自噬小体上聚集，证明细胞发生自噬。通过共聚焦显微镜观察2μg/ml TPT处理过12 h的A549细胞，其中吖啶橙(AO)染色呈现阳性，提示细胞中出现大量嗜酸性小体。另外，通过Westem blot检测LC3由Ⅰ型逐渐转化为Ⅱ型，P62则不断减弱，呈TPT剂量和时间依赖性。以上结果说明TPT能够诱导A549细胞发生自噬。
⑸以低浓度10μg/mLCQ处理A549细胞，通过免疫印迹法检测可见随着药物处理时间的延长，LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的聚集不断增强，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ聚集更加明显；当10μg/mL CQ与2μg/mLTPT联用12h后，也可发现LC3-Ⅱ及P62的明显的聚集。为证明白噬在TPT所诱导的肿瘤细胞死亡当中发挥的作用，我们采用稳定敲除Atg5的A549细胞进行实验，通过MTT检测，结果发现TPT对Sh-Atg5 A549细胞的增殖抑制比A549细胞明显增高。
⑹采用Westren Blot法检测TPT和CQ单药或联用对于Bcl-2家族蛋白表达的影响，结果发现单独应用10μg/mL CQ对Bcl-2和Bax没有影响，单独应用2μg/mLTPT，Bcl-2下降明显，而Bax有所上升，但两药联用与TPT单药相比两种蛋白的变化不大。对于BH3-only蛋白家族的Bim，Bid，两药单独或联合应用对其影响都不大。结果说明CQ对于TPT诱导凋亡的增敏作用是不依赖于Bcl-2家族和LMP的作用的。
⑺通过MTT法检测可发现TPT对结肠癌细胞SW620、SW480、Colo205、LoVo均具有增殖抑制作用，其IC50值分别为0.402±0.11μg/mL，0.399±0.08μg/mL，0.569±0.05μg/mL，1.693±0.21μg/mL。
⑻通过MTT检测，联合用药组LoVo细胞的生长抑制率高于同浓度的CQ和TPT单药组。在一定药物浓度范围内两药联用的CI值为0.60±0.15，说明两药联用对于LoVo细胞的生长抑制具有协同作用。
⑼通过免疫印迹法检测可见随着TPT作用浓度和作用时间的改变，自噬发生的标志性蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化不断增强，而P62蛋白的表达则不断减弱。通过共聚焦显微镜观察稳定转入pYFP-LC3的LoVo细胞，如图1C，对照组胞质内可见弥漫分布的绿色荧光，2μg/mL TPT处理12 h后，胞质内的绿色荧光呈点状聚集，表明自噬体的形成。
⑽以低浓度10μg/mL CQ处理LoVo细胞，通过免疫印迹法检测可见随着药物处理时间的延长，LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的聚集不断增强，LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ聚集更加明显，P62的聚集也不断增强，当10μg/mL CQ与2μg/mL TPT联用12h后，也可发现LC3-Ⅱ及P62的明显的聚集。通过共聚焦显微镜观察，10μg/mL CQ处理12h后，胞质内的绿色荧光呈点状聚集，当与2μg/mL TPT联用后，通过计数发生自噬的细胞(胞质内YFP-LC3≥5个)，可发现点状聚集增多。
⑾通过免疫印迹法检测结肠癌细胞株SW620、SW480、Colo205、LoVo中自噬相关蛋白Beclin1的表达水平，发现LoVo细胞中的Beclin1表达水平较其他明显偏高；用siRNA干扰Beclin1，阴性对照为一无意义的RNA片段，24h后应用2μg/mL TPT处理24h，通过免疫印迹法发现Beclin1-siRNA组Beclin1表达显著下调，说明干扰有效；收集细胞并利用台盼蓝染色法计数死细胞并计算死亡率，取三次实验的平均值，结果发现在干扰Beclin1之后，TPT引起的细胞死亡数目较NC组明显增多，通过统计学分析，Control-siRNA+TPT和Beclin1-siRNA+TPT两组数据的差别具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：①氯喹能够在体外增强拓扑替康对肺癌细胞和结肠癌细胞的增殖抑制作用；②氯喹通过阻断拓扑替康所诱导的自噬提高其对肺癌细胞和结肠癌细胞的杀伤作用；③氯喹能够增强拓扑替康对肺癌细胞当中SP细胞的抑制作用；④氯喹通过Bcl-2非依赖的形式增强拓扑替康所诱导的肺癌细胞的凋亡。