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背景原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是目前世界范围内的多发性肿瘤，也是严重危害人类生命的恶性肿瘤，其发病率位居全球恶性肿瘤的第五位，死亡率居我国乃至亚洲恶性肿瘤的第二位。肝癌起病隐匿，绝大部分患者就诊时已处于肿瘤发展的中晚期，错过手术治疗最佳时机，患者预后差，死亡率高。造成这种结果的主要原因是肝癌的高侵袭性和肝内和（或）肝外转移。目前其确切的机制仍不完全清楚，因此阐明肝细胞癌转移的分子调节机制对于肝癌的早期诊断、转移预测以及干预治疗均具有重要的研究意义。沉默信息调节因子2（silent information regulator2，Sir2）是一类依赖于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，它最先从酵母中分离出来，在哺乳动物中有7个Sir2的同源物，分别是SIRT1-SIRT7，即构成了sirtuin家族。随后的研究发现Sir2的过表达可以延长酵母、蠕虫及果蝇的寿命，这一重要发现极大推动了研究者们将研究焦点集中在哺乳动物的sirtuin家族上，其功能参与细胞寿命、代谢调节、炎症反应以及肿瘤发生发展等过程。SIRT1是目前研究最为深入的一个，它具有去乙酰化酶活性，通过与多种组蛋白及非组蛋白相互作用，将底物乙酰基转移到NAD+的ADP-核糖基部分，从而维持正常细胞中组蛋白的低乙酰化状态和非组蛋白的正常基因水平调控。然而，越来越多的证据表明，异常表达的SIRT1与恶性肿瘤的发生发展密切相关，通过对癌基因或抑癌基因去乙酰化修饰而发挥其作用，因此肿瘤侵袭转移和SIRT1的关系也成为科学家们的研究热点。目前，SIRT1已被证实在不同的细胞背景或肿瘤环境下发挥不同的功能。例如，在前列腺癌组织中，SIRT1既能诱导上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）发生又能逆转EMT过程，并且调节上皮标志物E-cadherin和间质标志物fbronectin、N-cadherin的表达。另外，有研究证实SIRT1在人肝癌细胞系和肝癌组织中表达明显增高，而SIRT1沉默能抑制肝癌细胞的增殖能力，诱导细胞凋亡，提示SIRT1可能参与了肝癌的发生发展。上皮间质转化是上皮细胞获得间质表型向间质细胞转化的现象，它是上皮源性肿瘤进展中的一个重要过程，通过其上皮标志物和间质标志物的表达来反映EMT的发生。既往研究表明EMT在肝癌的侵袭转移中也起到了关键性作用，我们推测EMT相关的转录因子是SIRT1的潜在靶基因。但是SIRT1是否参与肝癌的侵袭和转移？SIRT1在肝癌侵袭转移中的作用是否通过介导EMT来实现的？以SIRT1为靶点的干预能否有效逆转肝癌细胞的转移特性？这些问题仍不清楚。因此，SIRT1在肝癌侵袭转移中的作用及机制还需进一步的研究和探索。目的本文旨在探讨SIRT1在肝癌侵袭转移中的作用及其分子机制，从新的角度阐述肝癌转移的分子通路，为寻找新的治疗靶点提供理论依据。方法1.收集99例原发性肝癌和相应癌旁组织的标本及相关临床资料，采用免疫组织化学法检测SIRT1在肝癌组织和相应癌旁组织中的表达。采用χ2检验比较在肝癌组织和癌旁组织中SIRT1表达定量的差异，同时分析SIRT1表达与患者临床病理特征及预后的关系。2.选择具有不同侵袭转移潜能的人肝癌细胞系SMMC-7721、Hep-G2、Hep-3B及Huh7,采用real-time PCR和Western Blotting的方法分别检测SIRT1在mRNA水平和蛋白水平的表达，从而确定后续实验用细胞系。3.应用重组腺病毒体外转染技术，将携带有SIRT1基因（Ad-SIRT1）和SIRT1siRNA（sh-SIRT1）的腺病毒转入实验用细胞，分别上调和下调SIRT1的表达。转染后48h检测转染效率，并检测转染后SIRT1的表达。4.体外观察SIRT1对肝癌侵袭转移能力的影响：在肝癌细胞中应用SIRT1激活剂resveratrol、抑制剂nicotinamide及腺病毒Ad-SIRT1、sh-SIRT1来上调或下调SIRT1的活性或表达，观察肿瘤细胞侵袭转移（划痕实验、Transwell实验）能力的变化。5.建立裸鼠脾脏注射肝转移动物模型，体内验证SIRT1对肝癌的转移能力是否有影响。6.探讨EMT是否参与了SIRT1的调控作用，在肝癌细胞中改变SIRT1活性后利用RT-PCR检测EMT相关基因的表达，并观察EMT相关基因免疫荧光染色的变化。结果1.与癌旁组织相比，肝癌组织中SIRT1阳性表达率更高（P<0.001）。SIRT1表达与肝癌患者肿瘤大小（P=0.043）、肿瘤数目（P=0.031）以及TNM分期（P=0.038）有关；SIRT1表达阳性的肝癌患者生存期明显低于低表达患者（P=0.035）。2.在肝癌细胞系中SIRT1均有表达，我们选定SIRT1蛋白水平表达较高的SMMC-7721和Hep-G2作为实验用细胞系。3.在MOI为10、50、100的条件下，重组腺病毒Ad-SIRT1转染效率依次为30%、87%、95%，sh-SIRT1转染效率依次为30%、55%、78%，且荧光强度呈剂量依赖性。Ad-SIRT1转染48h后SIRT1蛋白表达显著增加；而sh-SIRT1转染后其表达明显降低。4.体外实验证实SIRT1对肝癌细胞的侵袭和转移能力均有明显的促进作用。5.体内实验表明过表达SIRT1后裸鼠的肝转移肿瘤数目明显增多。6.改变SIRT1的活性后影响EMT相关基因表达，从而证实了SIRT1可能通过介导EMT参与肝癌的侵袭和转移。结论1.SIRT1在肝癌组织和细胞中表达上调，过表达SIRT1能促进肝癌细胞体内和体外侵袭转移的能力，反之抑制SIRT1表达则降低侵袭转移能力，提示SIRT1在肝癌转移中起重要作用，并且有望成为一种新的肝癌预后参考指标。2.SIRT1通过介导EMT促进肝癌的侵袭和转移，因此有成为肝癌治疗新靶点的潜在可能性。