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脑皮质发育障碍(Malformations of cortical development，MCDs)是一种常见的神经系统发育异常性疾病，由于皮层发育过程中神经干细胞分化、迁移异常而发病。据统计，有接近80％的儿童难治性癫痫患者都有皮质发育障碍，是儿童难治性癫痫的主要病因之一。因此，研究MCDs的致痫机制，开发有效地治疗药物成为关注的热点和重点。 在胚胎发育过程中，大脑皮层的发育包含一系列的高度复杂有序的事件，包括神经细胞的增殖，分化和迁移。在皮层发育过程中，许多环境或遗传因素，可能会导致新生神经细胞异常增殖，分化和迁移，而最终表现为MCDs，其主要症状是癫痫发作。 局灶性皮质发育不良(Focal cortical dysplasia，FCD)和结节性硬化症(Tuberoussclerosis complex，TSC)是MCDs的两种重要分型。根据最新分类法，FCD又分为FCDⅠ型、FCDⅡ型和FCDⅢ型。FCDⅠ型组织学表现为皮质板层结构紊乱伴随成熟神经元异常放射状或层状排列。FCDⅡ型的组织学表现为皮层板层结构异常紊乱和出现异形神经元(FCDⅡa)或者异形神经元和气球样细胞同时出现(FCDⅡb)。大量研究发现，FCDⅡb与TSC在组织病理学和分子表型等方面具有高度的相似性，这说明FCDⅡb与TSC可能具有类似的发病及致痫机制。Cepeda等利用神经电生理技术研究发现，FCD皮质致痫灶中部分异形神经元的自发兴奋性增高，这些细胞可能是皮质致痫灶的致痫细胞。进一步研究证实，这些异形神经元可能来源于室管膜下区神经前体细胞(Subventricularzone-derived neuronal progenitor cells，SVZ-NPCs)的异常迁移和分化。本课题组之前的研究中发现，SVZ区NPCs的异常迁移可能是FCD发生的重要原因，因此对FCD皮质致痫灶中SVZ区NPCs来源的异形神经元的研究将有助于阐明FCD的发生和癫痫点燃机制。 传统型瞬时感受器电位离子通道(Canonical Transient receptor potential channel，TRPC)是位于细胞膜或细胞器膜上的一类重要的非选择性阳离子通道。有研究表明，TRPC通道蛋白参与神经元的分化、迁移以及突触可塑的过程中，并且对于神经元的存活发挥着非常重要的作用。TRPC5主要表达在中枢神经系统，作为非选择性阳离子通道主要对Ca2+通透。Phelan等人发现，TRPC5基因敲除鼠在匹鲁卡品致痫模型中，癫痫发生率明显降低，而且敲除鼠的长时程电位也有明显下降，此外，癫痫发作之后敲基因鼠的海马细胞的死亡率也大大下降。Greka等人发现，TRPC5在神经元的生长过程中起到负调节作用，当敲除TRPC5后，生长锥的长度明显延长，同时TRPC5也可能参与BDNF介导的生长锥导向，进而影响神经元迁移，最终可能参与癫痫的发生。以上研究结果提示TRPC5可能参与神经元发育和突触可塑性的过程，并可能参与到MCDs的发病当中，但是，目前关于TRPC5在癫痫发生中的具体作用机制还不清楚。 为了明确TRPC5蛋白在皮质发育障碍发生发展中的作用及其可能的致痫机制，我们建立了FCD动物模型，研究了TRPC5在MCDs神经元异常迁移中的作用，在课题组前期研究工作的基础上，探索了TRPC5对SVZ区来源的神经前体细胞(NPCs)向冰冻模型动物大脑冰冻损伤灶的迁移的影响。接下来，我们通过免疫组织化学、RT-PCR和Western blot等方法研究了TRPC5在TSC癫痫患者皮层致痫结节和FCD癫痫患者致痫皮层中的表达分布情况，探讨TRPC5在癫痫发作中可能的作用。 我们的主要研究结果如下所示: 一、TRPC5对SVZ区来源NPCs迁移的影响 在手术标本实验结果的基础上，我们建立了小鼠冰冻损伤模型，观察了TRPC5在这个模型中的表达情况，利用TRPC5的拮抗剂，我们研究了TRPC5对NPCs的迁移的影响。 1.首先我们成功地将eGFP病毒表达载体转染到了SVZ区细胞中，从SVZ区到皮层冰冻损伤病灶形成的微脑回，可见带状分布的eGFP阳性神经细胞，称之为冰冻损伤细胞迁移流(SFMS)。 2.通过免疫荧光双标我们发现，eGFP阳性细胞与神经干细胞标志物Nestin、SVZ区来源的具有迁移能力神经前体细胞标志物DCX和SVZ区细胞标记物PSA-NCAM共标，这说明冰冻损伤细胞迁移流中eGFP阳性细胞是由SVZ区神经前体细胞迁移而来。 3.我们观察了不同时期TRPC5在正常对照皮层和冰冻模型微脑回中的表达情况，结果显示随着年龄的增长和大脑的发育，TRPC5的表达量随之降低。但是和对照组相比，在P5、P10、P20和P30期，模型组的表达量明显高于对照组表达量，免疫组化结果也证实在冰冻损伤形成的微脑回区域，TRPC5的表达明显高于同期正常皮层以及微脑回周围的组织，为TRPC5在FCD的发生机制提供了形态学依据。 4.在P10期，使用SKF96365抑制TRPC5通道的活性后，实验组的细胞迁移流eGFP阳性细胞比照组细胞数量明显增加。说明TRPC5在神经前体细胞的迁移中起到抑制作用，可能同MCDs中大量异位细胞的出现密切相关。 二、TRPC5在皮质发育障碍患者癫痫病灶中的表达分布 1.在本研究中，我们利用TSC和FCD手术切除的致痫灶标本和正常对照皮层，分别研究了TRPC5在正常皮层与MCDs致痫灶中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况，发现在TSC和FCD致痫灶中，TRPC5的表达量相对于正常皮层明显升高。 2.利用免疫组化和免疫荧光双标法，我们发现TRPC5在结节性硬化皮质致痫结节和局灶性皮质发育不良皮质致痫灶中高表达于异构神经元上，表现出明显的细胞特异性，而这些异构神经元，大多与神经元特异性标志物共表达，表现为神经元谱系。这些结果说明，TRPC5可能在这些异构神经元的病理发生中发挥重要作用。 结论: 一、我们观察到向微脑回区迁移的细胞迁移流中有eGFP+的细胞，在使用SFK96365特异性抑制TRPC5蛋白通道的活性之后，迁移流中eGFP+细胞数量明显增加。这说明，TRPC5可能对对MCDs中出现的异位神经元密切相关。 二、TSC癫痫患者皮层致痫结节和FCD癫痫患者致痫皮层中TRPC5表达显著上调，并且特异性性地高表达于异形神经元、巨细胞和气球样细胞等这些与癫痫放电活性相关的异构神经元上。 综上所述，本文的研究结果提示我们TRPC5与脑皮质发育不良的发生机制密和致痫过程切相关，可能成为潜在的药物靶点。