论文部分内容阅读
肺癌是全球范围内发病率和死亡率处于首要地位的的恶性肿瘤,2012年公布的统计数据显示,全球大约每年有180万新增肺癌病例,占肿瘤发生总人数的近13%,它是男性中最常见的癌症,在女性中位居第二。肺癌具有进展快、侵袭力高及死亡率高等特点,已经成为死亡人数最多的癌症类型。肺癌主要分为小细胞癌(small cell cancer,SCLC)和非小细胞癌(non-small cell cancer,NSCLC),其中后者约占所有肺癌类型的80%。NSCLC则主要包括了腺癌、鳞癌、大细胞癌等多种类型,腺癌则是主要类型。目前外科手术切除癌组织是早期非小细胞肺癌的首选治疗方法,但多数患者确诊时已处于晚期或进展期,因此只有不到50%的患者能够进行手术治疗。多数患者则要依赖于化疗、放化疗和分子靶向治疗等综合治疗。尤其是分子靶向治疗的应用与研究已经成为现阶段医学界的一个方向,越来越多的研究集中在各种肺癌的分子研究中。在过去10年中,由于一些新药物和基于不同组织学亚型和驱动突变的个体化治疗方法的引入,使得部分肺癌患者的生存质量和总生存期大大改善。针对表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)和间变性淋巴瘤激酶基因(Anaplastic Lymphoma kinase,ALK)等的基因靶向治疗改变了NSCLC的诊断与治疗。但部分患者不存在上述基因相关的改变,尽管经过努力并积极进行治疗,预后仍然很差。因此,更多的分子驱动基因仍有待研究。血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin,THBS)是最初发现于血小板中的糖蛋白,但也可以由许多正常和转化的细胞合成和分泌。THBS1(thrombospondin1,THBS1)是该家族中第一个被确定的成员,并且参与调节肿瘤的进展与转移。THBS1抑制内皮细胞增殖、迁移和血管形成,并诱导内皮细胞凋亡。因此,THBS1是在生理和病理条件下,包括在恶性肿瘤背景下的血管生成的内源性抑制剂。然而,THBS1也可以刺激血管生成。因此,THBS1的血管生成相关功能非常复杂。总结研究发现THBS1在肿瘤中的表达及功能也相当复杂,乳腺癌、宫颈癌、胰腺导管腺癌、前列腺癌和膀胱癌等实体瘤中的表达下降,并且其表达水平与甲状腺癌、肺鳞状细胞癌癌、前列腺腺癌、膀胱癌的恶性分级呈负相关。但也有研究显示THBS1在乳腺癌和结肠直肠癌中的表达是增加的,并促进癌细胞的迁移。此外,有关THBS1在恶性肿瘤的进展中的病理意义和作用的矛盾结果也已在一些动物实验、人类病理学研究和全面性综述中被描述。有关THBS1在人肺腺癌中的研究极其有限,个别研究显示其表达与肺腺癌无明确相关性,个别研究证实其可能与肺腺癌的预后相关,其与肺腺癌的关系尚未得到明确。为深入探讨THBS1与肺腺癌发生和发展的关系,寻求新的治疗肺腺癌的靶基因,本研究采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)EnVision法检测53例肺腺癌组织和53例正常组织中THBS1蛋白的表达,并联合运用免疫组织化学法、Western blotting和实时荧光定量聚合酶链锁反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)检测4例肺腺癌组织和4例正常组织中THBS1蛋白和mRNA的表达,分析THBS1表达与肺腺癌病人临床病理学参数之间的关系,初步阐明其在肺腺癌发生发展中的作用。然后,分析多种肺腺癌细胞株中THBS1的表达情况,在此基础上,成功构建了THBS1真核表达载体pcDNA-THBS1,然后将其转染入THBS1表达低的肺腺癌细胞中,分别应用Western blotting、qRT-PCR联合检测了肺腺癌细胞转染前后各组中THBS1蛋白和mRNA的表达水平;另外将THBS1siRNA转染入THBS1表达高的肺腺癌细胞中,分别应用Western blotting、qRT-PCR联合检测了肺腺癌细胞转染前后各组中THBS1蛋白和mRNA的表达水平;并用流式细胞术检测转染前后腺癌细胞的细胞凋亡及生长周期的改变;分析了THBS1变化对caspase-3、MMP-2(matrix metalloprotein 2)、MMP-9(matrix metalloprotein 9)的影响,划痕实验观察了转染前后细胞迁移能力的变化。最后通过裸鼠移植瘤实验,比较各组裸鼠成瘤的大小,并采取免疫组织化学、Western blotting和qRT-PCR联合检测了THBS1等在裸鼠移植瘤中的表达情况。本实验从基因、蛋白、细胞定位及肿瘤细胞生物学行为、体内裸鼠成瘤实验等多个方面深入探讨THBS1的表达及活性在肺腺癌发生发展的作用,试图阐明THBS1的表达在肺腺癌发生、发展中的意义;并进一步阐明THBS1基因在肺腺癌发生、发展中的作用及机制,为THBS1作为肺腺癌病人的新的分子治疗靶点提供理论依据和实验证据。本研究共分以下3个部分。第一部分THBS1在肺腺癌中的表达及其临床病理意义方法1.采用免疫组织化学EnVision法检测53例正常肺组织以及53例肺腺癌组织中THBS1蛋白的表达,并分析THBS1蛋白的表达与临床病理学参数之间的关系。2.采用Western blotting检测随机选取的4例肺腺癌组织和相对应的4例正常肺组织中THBS1蛋白的表达。3.采用qRT-PCR检测随机选取的4例肺腺癌组织和相对应的4例正常组织中THBS1mRNA的表达。4.统计学分析:所有的数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(sx±)表示,免疫组织化学结果采用卡方分析,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05具有显著性。结果1.免疫组化显示THBS1蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞质内,在正常肺泡上皮细胞内无表达或者表达量较低。组间比较具有统计学差异(P<0.05)。2.Western blotting半定量检测示THBS1蛋白在肺腺癌组织中的表达高于正常肺组织。3.qRT-PCR检测显示THBS1mRNA在肺腺癌组织的水平高于正常肺组织。4.淋巴结转移者的肺腺癌组织THBS1蛋白表达高于没有淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.05)。5.THBS1蛋白表达与肺腺癌患者的年龄、性别、肿瘤直径及组织学分级无关(P>0.05)。第二部分THBS1基因的分子克隆和真核表达载体的构建及其对人肺腺癌细胞株A549和H1975生物学功能的影响方法1.采用实时荧光定量PCR用检测不同肺腺癌细胞株中THBS1 mRNA的表达;Western blotting检测不同肺腺癌细胞株中THBS1蛋白的表达。2.从肺癌组织组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出人THBS1基因;采用HindIII和XbaI进行双酶切PCR产物和pcDNA3.1空载体,T4 DNA连接酶连接pcDNA3.1空载体片段和目的片段,转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。PCR鉴定正确的克隆,提取重组质粒pcDNA-THBS1或空载体pcDNA3.1(+),构建THBS1基因的真核表达载体pcDNA3-THBS1并经酶切鉴定。3.采用脂质体2000将control siRNA(100 Nm)和THBS1 siRNA(100 Nm)转染THBS1表达量最高的肺腺癌A549细胞;并用脂质体2000将真核表达载体pcDNA3-THBS1和空载体pcDNA3.1导入THBS1表达量最低的H1975细胞。采用Western blotting和RT-PCR检测不同组别的肺腺癌A549细胞和H1975细胞中THBS1蛋白的表达。4.采用新型的CCK-8试剂盒分析转染前后不同组别的肺腺癌A549细胞和H1975细胞增殖的改变。5.采用流式细胞术分析不同组别的肺腺癌A549细胞和H1975细胞的细胞周期及细胞凋亡的变化。检测各组A549细胞和H1975细胞中caspase-3活性。进一步剖析THBS1引起凋亡变化的可能的分子机制。6.采用细胞划痕实验检测THBS1表达变化对不同的肺腺癌A549和H1975细胞迁移的影响。7.采用Western blotting技术分析不同处理组别的肺腺癌细胞中与迁移和侵袭密切相关的分子MMP-2和MMP-9的表达。8.统计学分析:所有的数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(sx±)表示,二组之间的比较采用t检验,三组及三组以上的比较采用单因素方差分析,以P<0.05具有统计学差异。结果1.肺腺癌细胞株A549、PC9和Calu3呈现出相对较高的THBS1 mRNA的表达水平,而H1299、H358、H1975和PG49细胞呈现出相对较低的THBS1 mRNA的表达水平。A549细胞株中THBS1蛋白表达量最高,H1975细胞株中THBS1蛋白表达量最低,在其它细胞株中均呈现出不同的表达量,介于A549和H1975之间。2.PCR扩增得到了特异性的大小约为3500bp基因片段。PCR鉴定、酶切鉴定pcDNA-THBS1重组载体,能成功从重组质粒中扩增出500bp左右的片段,提示成功构建了pcDNA-THBS1的真核表达载体。转染pcDNA-THBS1真核表达载体后,H1975细胞均能稳定表达THBS1 mRNA及蛋白。3.THBS1 siRNA处理的A549细胞比未处理和control siRNA处理的A549细胞中THBS1 mRNA和蛋白表达显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而未处理和control siRNA处理的A549细胞相比,THBS1 mRNA和蛋白的表达无差异(P>0.05)。与未处理的和空载体pcDNA3.1转染的H1975细胞相比,pcDNA3.1-THBS1组中H1975细胞中THBS1 mRNA和蛋白表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),而未处理的H1975和空载体pcDNA3.1转染的H1975细胞之间相比,THBS1 mRNA和蛋白的表达无差异(P>0.05)。4.与未处理的A549细胞和control siRNA转染的A549细胞相比,THBS1siRNA处理的A549细胞的增殖能力被显著抑制(P<0.05),而未处理的A549细胞和control siRNA处理的A549细胞之间相比,A549细胞的增殖能力无差异(P>0.05)。与未处理的和空载体pcDNA3.1转染的H1975细胞相比,pcDNA-THBS1组的H1975细胞的增殖能力显著增强(P<0.05),而未处理的和空载体pcDNA3.1处理的H1975细胞之间相比,H1975细胞的增殖能力无差异(P>0.05)。5.THBS1 siRNA处理的A549细胞中G0/G1期的细胞数的比率显著高于未处理和control siRNA处理的A549细胞,且差异具有统计学意义(P=0.000);THBS1 siRNA处理的A549细胞中S期的细胞数的比率显著低于未处理和control siRNA处理的A549细胞,且差异具有统计学意义(P=0.004);THBS1 siRNA处理的A549细胞中G2/M期的细胞数的比率显著低于未处理和control siRNA处理的A549细胞,差异具有统计学意义(P=0.015)。pcDNA-THBS1组中G0/G1期的细胞数的比率显著低于未处理组和空载体pcDNA3.1组,且差异具有统计学意义(P=0.000);pcDNA-THBS1组中S期的细胞数的比率显著高于未处理和空载体pcDNA3.1组的H1975细胞,且差异具有统计学意义(P=0.000)。然而,pcDNA-THBS1组、未处理组和空载体pcDNA3.1组中G2/M期的细胞数比率无统计学差异(P>0.05)。6.THBS siRNA组中caspase-3活性显著高于未处理组和control siRNA组,差异具有统计学意义(P=0.001)。而pcDNA-THBS1组中caspase-3活性显著低于未处理组和空载体pcDNA3.1组,且差异具有统计学意义(P=0.001)。7.与未处理的肺腺癌A549细胞和control siRNA转染的A549细胞相比,THBS1 siRNA转染的肺腺癌A549细胞的迁移受到显著抑制。而与未处理的肺腺癌H1975细胞和空载体pcDNA3.1转染的H1975细胞相比,pcDNA-THBS1转染的H1975细胞的迁移能力明显增强。8.与未处理的肺腺癌A549细胞和control siRNA转染的A549细胞相比,THBS1 siRNA处理的肺腺癌A549细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。而与未处理的H1975和空载体转染的H1975细胞相比,pcDNA-THBS1转染的H1975细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分THBS1基因对裸鼠移植瘤生长的调控作用及机制研究方法1.将未处理组、control siRNA组和THBS1siRNA组的肺腺癌细胞株A549细胞分别注入裸鼠皮下,然后比较各组裸鼠成瘤的大小。2.采用Western blotting和qRT-PCR检测各组裸鼠肿瘤组织中THBS1基因的mRNA表达情况。3.采用免疫组织化学EnVision法检测各组裸鼠肿瘤组织中THBS1、caspase3、MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况。4.统计学分析:所有数据均采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(sx±)表示,采用卡方和方差分析,以P<0.05具有显著性。结果1.THBS1siRNA组裸鼠移植瘤体积小于未处理组、control siRNA组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.THBS1siRNA组裸鼠移植瘤中THBS1蛋白表达显著低于未处理组、control siRNA组裸鼠移植瘤的表达,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3.THBS1siRNA组裸鼠移植瘤中THBS1mRNA水平显著低于未处理组、control siRNA组裸鼠移植瘤的水平,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4.THBS1siRNA组裸鼠移植瘤中caspase-3表达高于未处理组、control siRNA组裸鼠移植瘤的水平,MMP-2和MMP-9的蛋白表达低于未处理组、control siRNA组裸鼠移植瘤的水平(P<0.05)。结论1.THBS1基因在肺腺癌中过表达,与肺腺癌浸润转移相关。2.成功构建真核表达载体pcDNA3-THBS1;脂质体2000将真核表达载体pcDNA3-THBS1或THBS1 siRNA(100 Nm)转染肺腺癌细胞为进一步研究THBS1的生物学功能和靶向治疗奠定基础。3.THBS1 siRNA或pcDNA3-THBS1可分别下调或上调肺腺癌细胞THBS1mRNA和蛋白的表达。4.下调THBS1可促进肺腺癌细胞凋亡,抑制肺腺癌浸润转移。